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新疆鹰嘴豆根瘤菌的生物学特征研究

作　者: 张俊杰
导　师: 陈文新
学　校: 中国农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 鹰嘴豆根瘤菌木垒中慢生根瘤菌新疆
分类号: S154.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

鹰嘴豆是药膳兼用的豆科植物,具有非常好的结瘤固氮能力。但分布在中国境内的能与鹰嘴豆共生固氮的根瘤菌至今未对其做过任何研究。鉴于此,本论文首次针对分布在我国主产区——新疆木垒县和奇台县的鹰嘴豆根瘤菌进行系统的生物学特征研究,以填补此方面研究的空白。论文先对我国新疆地区的鹰嘴豆根瘤菌进行了遗传多样性分析。从鹰嘴豆主产区新疆木垒和奇台两个县采集根瘤,经过分离纯化得到95株根瘤菌,采用16S rRNA基因和IGS-PCR RFLP、16S rRNA基因、三个持家基因(atpD、recA和gln11)和两个共生基因(nodC和nifH)的系统发育和分子进化分析。结果表明：1)供试根瘤菌全部属于中慢生根瘤菌属,但不同于该属的已知种,为潜在的新基因种；2)这些根瘤菌的共生基因与国外已报道的鹰嘴豆根瘤菌——Mesorhizobium mediterraneum和M. ciceri的相似性高达98.6%(nodC)和97.9%(nifH)以上,交叉结瘤试验也证明其与宿主植物严格的专一性和对应性；3)采集地的土壤pH值呈碱性(8.24-8.45),这与中慢生根瘤菌在生长时产酸,以中和并适应土壤的碱性特征相关；4)新疆鹰嘴豆根瘤菌种群与M. mediterraneum、M. ciceri和M. temperatum之间的分化系数(Kst*)分别为0.44227、0.48364和0.31383,而基因交流系数(Nm)分别为0.03、0.02和0.04,另外,M.mediterraneum、M. ciceri和M. temperatum相互间的分化系数(Kst*)均为1.0000,而基因交流系数(Nm)均为0.00。说明新疆鹰嘴豆根瘤菌种群与三个已知种之间遗传分化较多,基因交流较少,这表明新疆鹰嘴豆根瘤菌种群既与国外己知的两个鹰嘴豆根瘤菌种群不同,也与遗传距离较近的M. temperatum不同,由此推测,新疆特殊鹰嘴豆根瘤菌种群可能是在长期地理隔离及鹰嘴豆对根瘤菌共生基因选择的共同作用下形成的。在以上研究基础上,论文又对新疆鹰嘴豆根瘤菌的潜在新基因种进行多相分类鉴定。经过多序列基因比对、系统发育分析、全细胞蛋白电泳、脂肪酸种类和含量、极性脂种类分析、DNA同源性、数值分类和交叉结瘤试验等综合分析,结果表明：新疆鹰嘴豆根瘤菌种群属于中慢生根瘤菌属的一个新种,命名为木垒中慢生根瘤菌(Mesorhizobium muleiense sp. nov.)。为研究根瘤菌在自然条件下的进化规律和生态适应性,在最初采样研究的四年后,又重新采集了原采样点的鹰嘴豆根瘤和土壤样品,开展了鹰嘴豆根瘤菌的持家基因recA分析、生态适应性和竞争结瘤试验等工作。研究发现,田间重采集根瘤菌的持家基因recA较好地保持了木垒中慢生根瘤菌种群recA基因型的多样性和稳定性,与四年前的结果一致；而经过温室条件下鹰嘴豆从土壤中捕捉的方法得到的根瘤菌,其recA序列与四年前相比,缺少了CCBAU83939所代表的recA基因型。但是,两种条件下得到的鹰嘴豆根瘤菌都归属于唯一的种,即M. muleiense。说明种群M. muleiense在新疆土壤中保持着相对的遗传稳定性。使用四年前分离的M. muleiense与M. mediterraneum和M. ciceri进行的土壤适应性和竞争结瘤分析表明,灭菌的蛭石和土壤内,M. ciceri的占瘤率最高,M. mediterraneum次之；而未灭菌土壤内,M. muleiense占瘤率最高,表现出土著菌M. muleiense的生态适应性和高竞争性。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-13
第一章绪论  13-39
  1.1 引言  13-14
  1.2 文献综述  14-39
    1.2.1 根瘤菌-豆科植物高效共生固氮体系的建立  14-17
    1.2.2 根瘤菌分类的研究方法及新种的描述标准  17-19
    1.2.3 根瘤菌多样性及系统学的研究方法  19-25
    1.2.4 鹰嘴豆及其根瘤菌多样性研究进展  25-31
    1.2.5 鹰嘴豆及其根瘤菌的抗逆性研究进展  31-34
    1.2.6 鹰嘴豆根瘤菌的竞争结瘤试验研究进展  34-35
    1.2.7 本研究的目的和意义  35-36
    1.2.8 本研究的技术路线  36-37
    1.2.9 本研究所受基金资助情况  37-39
第二章新疆鹰嘴豆根瘤菌多样性研究  39-71
  2.1 引言  39
  2.2 实验材料  39-41
    2.2.1 新疆鹰嘴豆根瘤菌采样点及鹰嘴豆品种信息  39
    2.2.2 培养基  39-40
    2.2.3 实验试剂  40-41
  2.3 实验方法  41-51
    2.3.1 根瘤菌分离纯化与保存  41
    2.3.2 根瘤菌回接结瘤试验  41-42
    2.3.3 根瘤菌基因组DNA的提取  42
    2.3.4 16S rRNA-PCR RFLP  42-43
    2.3.5 16S-23S rRNA基因间区段PCR-RFLP  43-44
    2.3.6 16S rRNA基因测序和系统发育分析  44
    2.3.7 持家基因的PCR扩增测序及系统发育分析  44-46
    2.3.8 共生基因的序列扩增、测序和系统发育分析  46-47
    2.3.9 根瘤菌基因组DNA-BOX-PCR指纹图谱分析  47-48
    2.3.10 基因组DNA G+C含量测定与DNA同源性分析  48-50
    2.3.11 采样点土壤生理生化指标的测定  50
    2.3.12 共生基因的突变位点分析  50-51
    2.3.13 持家基因的遗传分化与基因交流分析  51
  2.4 实验结果与分析  51-69
    2.4.1 新疆鹰嘴豆根瘤菌的遗传基因多样性  51-63
    2.4.2 新疆鹰嘴豆根瘤菌的共生基因多样性  63-64
    2.4.3 共生基因的突变位点分析  64-66
    2.4.4 持家基因的遗传分化与基因交流分析  66
    2.4.5 BOX-PCR聚树分析结果  66-67
    2.4.6 DNA-DNA同源性分析结果  67-68
    2.4.7 采样点土样生理生化指标测定结果分析  68-69
  2.5 讨论  69-71
第三章木垒中慢生根瘤菌分类地位的确定  71-93
  3.1 引言  71
  3.2 材料  71-73
    3.2.1 实验中使用的菌株  71
    3.2.2 培养基  71-73
  3.3 实验方法  73-81
    3.3.1 16S rRNA基因序列测定及系统发育分析  73
    3.3.2 持家基因序列测定及MLSA  73
    3.3.3 全细胞可溶性蛋白SDS-PAGE分析  73-75
    3.3.4 基因组DNA(G+C)mol%含量测定与DNA同源性分析  75
    3.3.5 表型性状的测定  75-79
    3.3.6 供试菌株脂肪酸含量的测定  79-80
    3.3.7 供试菌株所含极性脂种类的鉴定分析  80-81
    3.3.8 交叉结瘤实验  81
    3.3.9 代表菌株CCBAU 83963~T的革兰氏染色  81
  3.4 实验结果与分析  81-92
    3.4.1 16S rRNA基因和持家基因的系统发育分析  81-83
    3.4.2 全细胞可溶性蛋白SDS-PAGE结果与分析  83-85
    3.4.3 基因组DNA的同源性分析和(G+C)mol%含量的测定结果  85-86
    3.4.4 代表菌株的表型特征和数值分类  86-88
    3.4.5 代表菌株的生化试验结果与分析  88
    3.4.6 脂肪酸含量测定结果与分析  88-90
    3.4.7 极性脂鉴定结果与分析  90-91
    3.4.8 交叉结瘤试验结果  91
    3.4.9 革兰氏染色结果  91-92
  3.5 结论  92-93
第四章新疆鹰嘴豆根瘤菌自然进化与竞争结瘤试验分析  93-105
  4.1 引言  93
  4.2 实验材料  93
    4.2.1 根瘤和土壤样品的采集  93
    4.2.2 培养基的制备  93
    4.2.3 实验试剂的准备  93
  4.3 实验方法  93-97
    4.3.1 田间重采集根瘤的分析  93-94
    4.3.2 温室条件下重采集土壤样品中鹰嘴豆根瘤菌的捕捉与分析  94-95
    4.3.3 鹰嘴豆根瘤菌的生态适应性与竞争结瘤试验  95-97
  4.4 结果与分析  97-103
    4.4.1 土壤样品理化性质测定的结果  97-98
    4.4.2 田间重采集根瘤分离得到的根瘤菌recA的系统发育结果与分析  98
    4.4.3 温室土样捕捉到的鹰嘴豆根瘤菌的recA的系统发育结果与分析  98
    4.4.4 三株供试菌株的验证结果  98-100
    4.4.5 灭菌蛭石中根瘤菌与鹰嘴豆品种的匹配性分析  100-101
    4.4.6 灭菌土中鹰嘴豆根瘤菌的适应性  101
    4.4.7 灭菌蛭石和土壤中鹰嘴豆根瘤菌竞争结瘤  101-102
    4.4.8 未灭菌土壤中的竞争结瘤情况及占瘤率分析  102-103
  4.5 讨论  103-105
第五章结论与展望  105-109
  5.1 结论  105-106
  5.2 展望  106-109
参考文献  109-129
致谢  129-131
个人简历  131-132

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