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一株枯草芽胞杆菌的分离鉴定及其杀虫活性的研究

作　者: 刘慰
导　师: 夏立秋
学　校: 湖南师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 枯草芽胞杆菌 菌株鉴定 生理生化特性 杀虫活性 抑菌活性
分类号: S154.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


鳞翅目(Lepidoptera)是一种世界性危害广的害虫,每年给全球造成上亿美元的损失。因此深入挖掘丰富的菌株资源,筛选具有广谱高效杀虫毒力的菌株,对构建广谱高效工程菌、研制环保微生物杀虫剂具有重要的理论及实践意义。本论文以从土壤中自行分离的219株芽胞杆菌中筛选的一株枯草芽胞杆菌为研究对象,通过菌落形态观察、光学显微镜、激光共聚焦显微镜等进行镜检菌体形态以及16S rRNA基因同源性分析等一系列方法鉴定,该株细菌属枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis,命名为HX08,并将其16S rRNA基因序列提交上Genbank数据库,获得了登陆号KF774302。同时,从该菌株的生理生化特性方面进行了验证,如革兰染色实验、柠檬酸盐利用、明胶液化、吲哚实验、甲基红实验、V.P实验、卵磷脂酶实验、淀粉水解实验、纤维素水解实验、L-阿拉伯糖水解实验、D-葡萄糖水解实验、D-木糖水解实验等。并对该菌株的生长特性进行了一系列初步研究,包括生长曲线、最适pH值、培养过程中pH值变化情况及抗生素抗性等。研究了该菌株发酵不同时期下不同浓度的样品对棉铃虫幼虫(Helicoverpa armigera)的杀虫活性及致死毒力,结果发现,HX08菌株在60h发酵时间段对棉铃虫的致死效果最好。通过对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、铜绿杆菌、产气肠杆菌等多种病原细菌进行抑菌实验,发现该菌株在60h发酵时间段对鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌菌株的抑菌效果最明显。对该菌株发酵液提取的活性蛋白进行了初步研究,建立了HPLC技术分离体系,使用H20做流动相,以0.5mL/min流速洗脱,检测波长分别为215nm、254nm和280nm,收集第15mL收集管处即保留时间为31min的2号峰粗分离物活性较高。并切取SDS-PAGE胶目的蛋白质条带酶解,利用质谱(LTQ-MS)技术进行了分子特性分析,鉴定发现杀虫活性蛋白成分为草酸脱羧酶。本研究为丰富枯草芽胞杆菌菌种资源,挖掘微生物活性产物基因资源,进一步研究该菌的杀虫和抗菌活性物质奠定了重要基础。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第一章 前言  10-17
  1.1 芽胞杆菌的研究与应用  10
  1.2 枯草芽胞杆菌研究进展  10-15
    1.2.1 枯草芽胞杆菌的研究现状  10-11
    1.2.2 枯草芽胞杆菌的广泛应用  11-13
    1.2.3 枯草芽胞杆菌的代谢物质  13-14
    1.2.4 草酸脱羧酶的性质及应用  14-15
  1.3 立题依据和现实意义  15
  1.4 本研究的设计  15-17
第二章 材料和方法  17-34
  2.1 实验材料  17-21
    2.1.1 培养基  17-18
    2.1.2 抗生素  18
    2.1.3 供试昆虫  18
    2.1.4 供试病原菌  18
    2.1.5 酶和试剂  18-19
    2.1.6 常用溶液和缓冲液  19-20
    2.1.7 实验仪器和设备  20-21
  2.2 实验方法  21-34
    2.2.1 菌株的筛选分离和纯化  21
    2.2.2 生理生化分析和菌株分类鉴定  21-28
    2.2.3 HX08菌株生长特测定  28-30
    2.2.4 HX08菌株生物活性的测定  30-31
    2.2.5 HX08菌株活性物质的初步纯化分析  31-34
第三章 结果和分析  34-53
  3.1 枯草芽胞杆菌新菌株HX08的分离纯化  34
  3.2 HX08菌株鉴定  34-41
    3.2.1 菌株形态  34-37
    3.2.2 生理生化鉴定  37-38
    3.2.3 HX08菌株16S rRNA基因同源性分析  38-41
  3.3 HX08菌株的生长特性测定  41-44
    3.3.1 生长曲线测定  41-42
    3.3.2 培养过程中pH值变化情况与生长最适pH值  42-43
    3.3.3 实验室常用抗生素抗性鉴定  43-44
  3.4 HX08菌株生物活性测定  44-48
    3.4.1 杀虫活性分析  44-47
    3.4.2 抑菌效果分析  47-48
  3.5 活性物质初步分离和纯化  48-53
    3.5.1 HX08菌株全蛋白SDS-PAGE比对  48-49
    3.5.2 HX08菌株活性物质HPLC分离体系  49
    3.5.3 HX08菌株活性蛋白质质谱分析  49-53
第四章 小结与讨论  53-56
参考文献  56-61
硕士期间撰写和发表的与本课题相关的学术论文  61-62
致谢  62-63

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中图分类: > 农业科学 > 农业基础科学 > 土壤学 > 土壤生物学 > 土壤微生物学
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