学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

海洋桔青霉W1抗真菌蛋白的分离纯化与特性研究

作　者: 文超
导　师: 徐洵；陈新华
学　校: 厦门大学
专　业: 微生物学
关键词: 海洋微生物植物致病真菌抗真菌蛋白 PcPAF
分类号: S432.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
下　载: 0次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

植物致病真菌是造成主要粮食和经济作物减产的头号杀手,目前大量使用的化学农药已经对环境和人类健康造成了巨大的负面影响。同时开发新型化学农药的高成本及耐药微生物的迅速出现等因素,引起我们对生物农药的关注。其中,抗真菌蛋白因其来源广泛及其独特的作用机制,为新型抗真菌活性物质的研究提供了重要信息,并成为了研究热点。此外,陆地生物资源已被大量开发,发现新型抗菌物质的可能性不断下降,迫切需要寻找新的来源。海洋提供了非常特殊的生态环境,使海洋微生物能够进化出特殊的代谢途径,产生更多新型的抗菌活性物质,将在植物病原菌治理及活性物质开发方面发挥重要作用,因此,从海洋微生物中分离抗真菌蛋白具有重要的研究意义。为了从海洋中寻找具有高效抗菌活性的天然产物,本研究首先采用平板稀释法和平板扩散法从深海中筛选活性菌株。通过使用不同配方的培养基,对采集自各种海洋环境(大洋、北极和南极)的深海样品进行微生物菌株的分离筛选,筛选到了300余株真菌以及大量的细菌,其中包括了许多具有抗菌活性的微生物。接着以7株植物病原真菌和7株致病细菌为指示菌进一步筛选并鉴定出具有高效抗菌活性的菌株,植物病原真菌包括宛氏拟青霉、胶孢炭疽菌、尖孢镰刀菌、绿色木霉、立枯丝核菌、长柄链格孢和核盘菌,致病细菌包括金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、溶壁微球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气假单胞菌和黄单胞菌。本研究共分离到57株具有抗植物病原菌活性的菌株,包括53株活性真菌和4株细菌,分别鉴定种属并统计活性情况和样品来源,为研究海洋抗菌微生物资源以及开发新型抗菌活性物质奠定了良好的基础。更重要的是,本研究从西南印度洋底泥样品中分离并鉴定出一株桔青霉,命名为W1。该菌株的发酵上清对多株植物病原菌具有拮抗活性,并通过采用盐析、透析、冻干、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、超滤浓缩等方法,最终从海洋桔青霉W1发酵液上清中分离纯化到一种抗真菌蛋白,将它命名为PcPAF。 SDS-PAGE电泳结果表明,PcPAF的分子量大小约为10kDa。通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定以及N端测序分析该蛋白的序列,根据分析结果判断PcPAF可能为一种新的抗真菌蛋白,并检测了该抗真菌蛋白的理化性质。结果表明PcPAF对4株植物病原菌真菌,绿色木霉、宛氏拟青霉、长柄链格孢和胶孢炭疽菌具有较强的抑制活性,纸片法检测PcPAF对绿色木霉、尖孢镰刀菌、宛氏拟青霉以及长柄链格孢的最低抑制浓度分别为1.52μg/disc、6.08μg/disc、3.04μg/disc和6.08μg/disc.PcPAF在80℃条件下处理20min其活性不受影响；能够耐受多种金属离子处理,经过20mM的Mn2+处理后,能保持75%的抗菌活性；可以耐受酸性环境,并在弱酸环境中显示出最好的抗菌活性；此外,PcPAF对紫外辐射,多种有机溶剂、表面活性剂以及蛋白酶都有较好的耐受能力,在一般条件下都能保持较好的抗菌活性。PcPAF与已经报道的真菌来源的抗真菌蛋白在序列和性质上都存在一定差异,可能是一种新的真菌来源的抗真菌蛋白。通过在发酵培养基中加入甘氨酸能够明显挺高海洋桔青霉W1发酵上清的抗菌活性,抗菌活性提高约62%。此外,PcPAF在盆栽试验中都表现出较好的抗病效果,其中对小麦赤霉病的防效达到了52%。总之,本研究发现了一种抗真菌蛋白并命名为PcPAF,该蛋白具有较好的抗真菌活性和较广泛的抗菌谱,对外界环境具有较好的耐受力,通过添加营养源提高了发酵产物的抗菌活性,并在实际应用中具有一定的抗病效果,具有作为生物农药的潜在能力,为抗真菌蛋白PcPAF在作物抗真菌感染方面的应用奠定了基础。

全文目录

Content  7-11
摘要  11-13
Abstract  13-16
第一章前言  16-30
  1.1 真菌的危害  16
  1.2 微生物农药  16-17
  1.3 海洋活性微生物资源  17-19
    1.3.1 海洋微生物的多样性  18
    1.3.2 海洋微生物是新型活性物质的重要来源  18-19
  1.4 微生物来源的抗菌蛋白  19-25
    1.4.1 微生物来源抗菌蛋白的分类  19-24
    1.4.2 真菌来源抗菌蛋白的作用机制  24-25
  1.5 抗菌蛋白在农业防治中的应用  25-28
    1.5.1 利用抗菌蛋白控制植物疾病  25-26
    1.5.2 抗菌蛋白的合成  26-27
    1.5.3 利用转基因植物表达抗菌蛋白  27-28
  1.6 本课题的研究意义和目的  28-30
第二章材料与方法  30-50
  2.1 实验材料  30-39
    2.1.1 样品来源  30
    2.1.2 受试菌  30-31
    2.1.3 培养基  31-34
    2.1.4 寡核苷酸引物  34-35
    2.1.5 主要试剂及材料  35
    2.1.6 主要溶液  35-38
    2.1.7 主要仪器设备  38-39
  2.2 实验方法  39-50
    2.2.1 菌株的初筛及保藏  39
    2.2.2 拮抗活性菌株的复筛  39-40
    2.2.3 拮抗活性菌株的分子生物学鉴定  40-44
    2.2.4 粗蛋白的分离  44-45
    2.2.5 色谱分析法分离抗真菌蛋白  45-46
    2.2.6 硝酸银染色  46
    2.2.7 质谱分析  46
    2.2.8 N端测序  46-47
    2.2.9 抗真菌蛋白MIC(最低抑制浓度)测定  47
    2.2.10 抗真菌蛋白的理化性质分析  47-49
    2.2.11 添加营养源对发酵上清活性的影响  49
    2.2.12 抗菌物质应用于农作物病害防治  49-50
第三章结果与分析  50-91
  3.1 抗菌活性菌株的分离筛选及初步鉴定  50-69
    3.1.1 活性菌株筛选  50-57
    3.1.2 活性菌株的鉴定与统计  57-69
  3.2 海洋桔青霉W1抗真菌蛋白的分离纯化  69-78
    3.2.1 海洋真菌W1的鉴定  69-70
    3.2.2 海洋桔青霉W1发酵上清的抑菌活性  70-71
    3.2.3 饱和硫酸铵沉淀及抗菌物质的初步鉴定  71-72
    3.2.4 DEAE离子交换层析及活性检测  72-73
    3.2.5 CM离子交换层析及活性检测  73-74
    3.2.6 SDS-PAGE和硝酸银染色  74-75
    3.2.7 抗真菌蛋白的质谱分析  75-77
    3.2.8 抗真菌蛋白的N端测序分析  77-78
  3.3 海洋桔青霉W1抗真菌蛋白的理化性质分析  78-89
    3.3.1 抗真菌蛋白的MIC(最低抑制浓度)测定  78-81
    3.3.2 紫外辐射对抗真菌蛋白活性的影响  81
    3.3.3 温度对抗真菌蛋白活性的影响  81-83
    3.3.4 加热时间对抗真菌蛋白活性的影响  83-84
    3.3.5 金属离子对抗真菌蛋白活性的影响  84-85
    3.3.6 有机溶剂对抗真菌蛋白活性的影响  85-86
    3.3.7 pH对抗真菌蛋白活性的影响  86-87
    3.3.8 表面活性剂对抗真菌蛋白活性的影响  87-88
    3.3.9 蛋白酶对抗真菌蛋白活性的影响  88-89
  3.4 添加营养源对发酵上清活性的影响  89-90
  3.5 海洋桔青霉W1在作物病害防治上的应用  90-91
第四章小结与讨论  91-95
  4.1 小结  91-92
  4.2 讨论  92-95
展望  95-96
参考文献  96-102
附录1 第21次大洋科考采集的印度洋样品站位信息表  102-105
附录2 第22次大洋科考采集的南大西洋样品站位信息表  105-107
附录3 第26次大洋科考采集的南大西洋样品站位信息表  107-109
附录4 第5次北极科考采集的沉积物样品站位信息表  109-112
附录5 第28次南极科考采集的水样站位信息表  112-115
附录6 第29次南极科考采集的样品站位信息表  115-122
硕士期间发表的研究成果  122-123
致谢  123

海洋桔青霉W1抗真菌蛋白的分离纯化与特性研究

内容摘要

全文目录

相似论文