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K88ac~+和K88ad~+产肠毒素大肠杆菌hlyA基因缺失株的构建及相关功能初步分析

作　者: 姜露
导　师: 朱国强
学　校: 扬州大学
专　业: 微生物学
关键词: Red重组系统 hlyA基因突变株毒力实验
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)系一类致人和幼畜(初生羔羊、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻最常见的病原性大肠杆菌,其毒力因子主要包括黏附素菌毛、肠毒素、产志贺氏菌毒素、溶血素等。α-溶血素在ETEC的致病机理中很少受到关注,是一种RTX(repeats in toxin)毒素蛋白,对于大部分哺乳动物细胞(如红细胞、粒细胞、单核细胞和内皮细胞)都具有溶细胞活性和细胞毒性,能够整合进宿主细胞膜,影响细胞膜的稳定性,使其内容物渗漏或者裂解,是大肠杆菌肠外感染的一个重要的毒力因子。基于K88ac+/K88ad+ETEC都具有溶血素基因,且两者病原致病机理不尽相同。我们成功构建hlyA毒素基因缺失株,为进一步深入研究hlyA毒素与机体相互作用的分子机制,溶血素的致病机理及对猪大肠杆菌病的防控策略奠定一定基础。1、利用Red同源重组技术构建hlyA基因缺失株根据GenBank中已报道的ETEC hlyA基因的序列,首先合成一对引物(引物5’端与hlyA基因同源,而3’端与pKD3质粒上氯霉素抗性基因cat同源),经PCR扩增后得到具有氯霉素抗性基因和hly基因同源臂的产物,将PCR扩增产物直接转化入大肠杆菌中,在pKD46表达的重组酶作用下,PCR产物两端的hlyA基因同源序列与大肠杆菌染色体上的的同源序列发生同源重组交换,利用抗性筛选得到阳性一次重组菌。利用编码Flp重组酶的质粒pCP20,去除氯霉素抗性基因,最后在染色体上只留下一个FRT位点,得到二次重组菌,通过PCR扩增及测序鉴定缺失株的正确构建。本试验成功构建了大肠杆菌标准株K88ac、K88ad的hlyA基因缺失株。同时我们将表达hlyA基因的pBR322质粒导入缺失株,构建了互补株。2、溶血素在大肠杆菌致病过程中作用初探在K88ac△hlyA、K88ad△hlyA成功构建的基础上,比较分析了野生株和缺失株相关生物学特性的变化。体外生长实验和酵解实验表明,同样的培养条件下,缺失株K88ac△hlyA、 K88ad△hlyA株生长速度及生长周期各个阶段的特性与野生株相比基本没有差异,其分解发酵糖类和氨基酸的能力也未发生改变。同时将6周龄ICR小鼠分为1个对照组和6个攻毒组,经灌胃途径分别对各攻毒组小鼠接种109cfu剂量的大肠杆菌悬液,定期观察接种后小鼠的状态(饮食、饮水、精神状态和死亡情况),对死亡小鼠进行剖检记录病理变化,结果显示：经野生株和回补株攻毒的小鼠有出血死亡的现象,而缺失株没有,说明hlyA会影响大肠杆菌对ICR小鼠的致病性,增强大肠杆菌对ICR小鼠的毒力。在小鼠的十二指肠、空肠、回肠分离细菌,分别进行平板计数和PCR检测,结果表明：大肠杆菌在回肠的粘附能力比在十二指肠和空肠要强,且野生株和回补株比缺失株要强。

全文目录

中文摘要  3-5
Abstract  5-9
符号说明  9-10
文献综述  10-22
  1、K88菌毛  10-11
  2、溶血素  11-14
    2.1 溶血素的分类  11
    2.2 大肠杆菌溶血素的遗传性  11
    2.3 溶血素合成的调节与表达  11-12
    2.4 大肠杆菌溶血素的分泌系统  12-13
    2.5 溶血素的特性与功能  13
    2.6 溶血素与毒力  13-14
    2.7 溶血素与致病  14
  3、λ噬菌体的Red同源重组系统  14-17
    3.1 Red重组系统的主要蛋白及重组机制  15-16
    3.2 Red同源重组系统的应用  16-17
  参考文献  17-22
研究一、肠毒素大肠杆菌标准株K88ac、K88ad hlyA基因缺失突变株的构建及相关功能初步分析  22-44
  摘要  22
  Abstract  22-23
  1、材料  23-25
    1.1 菌株、质粒与抗体  23-24
    1.2 培养基和主要试剂及配制  24
    1.3 主要仪器  24-25
  2、方法  25-32
    2.1 K88ac、K88ad溶血素毒素检测  25-26
    2.2 PCR引物的设计  26
    2.3 融合PCR产物的制备及纯化  26-27
    2.4 感受态的制备及转化  27-28
    2.5 质粒pKD46的消除  28
    2.6 第一次同源重组菌△hlyA：：Cat的PCR鉴定  28-29
    2.7 FLP位点专一性重组  29
    2.8 第二次重组菌△hlyA的鉴定  29-30
    2.9 互补株的构建及验证  30-32
    2.10 不同血平板验证hlyA基因的缺失  32
    2.11 溶血活性的测定  32
  3、结果  32-41
    3.1 K88ac、K88ad溶血素毒素检测  32-33
    3.2 融合PCR产物的制备  33-34
    3.3 第一次重组菌△hlyA：：Cat的PCR鉴定  34
    3.4 第二次重组菌△hlyA的PCR鉴定  34-35
    3.5 鉴定引物扩增△hlyA菌株的序列分析  35-36
    3.6 互补株的构建及验证  36-38
    3.7 不同血平板验证hlyA基因的缺失  38-40
    3.8 溶血活性的测定  40-41
  4、讨论  41-43
  参考文献  43-44
研究二、肠毒素大肠杆菌K88ac、K88ad hlyA基因缺失突变株的相关功能性分析  44-58
  摘要  44
  Abstrat  44-45
  1、材料  45-46
    1.1 相关菌株和制品  45
    1.2 主要试剂及配制  45-46
    1.3 仪器设备  46
    1.4 实验动物  46
  2、方法  46-48
    2.1 细菌的生化鉴定  46
    2.2 生长试验  46
    2.3 小鼠毒力实验  46-48
  3、结果  48-55
    3.1 细菌生化实验  48-49
    3.2 突变株的生长曲线测定  49-50
    3.3 小鼠毒力实验结果  50-55
  4、讨论  55-57
  参考文献  57-58
全文小结  58-59
致谢  59-60

K88ac~+和K88ad~+产肠毒素大肠杆菌hlyA基因缺失株的构建及相关功能初步分析

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