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番茄斑萎病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

作　者: 习凤妮
导　师: 刘勇
学　校: 中南大学
专　业: 植物病理学
关键词: 番茄斑萎病毒 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 检测
分类号: S432.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的代表成员,该病毒的寄主范围广泛,对农业生产危害严重。已经被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。TSWV目前尚无有效的防治措施,研究该病毒快速高效的检测方法,有助于早期发现病毒并及时采取措施进行防治,从而减轻该病毒所造成的经济损失。本实验利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术,建立了TSWV的快速定量定性检测方法。根据TSWV外壳蛋白N基因序列,设计了实时荧光定量PCR的特异性引物,获得了140bp大小的片段,并将小片段克隆到PEASYTM-T5载体上,经过菌落PCR筛选、酶切、测序等结果表明,PCR扩增获得片段与N基因部分片段同源性高,表明设计的引物特异性好；且该片段已经成功连接至载体,得到了重组质粒。以得到的重组质粒作为实时荧光定量PCR的标准品,对标准品进行一系列的梯度稀释,选择6个梯度稀释的标准品为模板进行SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR反应,得到的标准曲线回归方程为y=-3.538x+37.233,该扩增反应的效率为91.7%,相关系数为0.978,检测范围为9.84×101copies/μL～9.84×106copies/μL。熔解曲线只出现特异性的单个峰,而没有明显的引物二聚体或者非特异性扩增的峰出现,证明该方法具有良好的特异性。组间和组内的重复性实验的结果CV值均小于3%,农明该方法具有良好的重复性和稳定性。样品检测结果表明,荧光实时定量PCR方法与ELISA和常规RT-PCR分析结果一致,而荧光实时定量PCR方法可以定量病毒含量。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 文献综述  10-23
  1.1 番茄斑萎病毒简介  10-18
    1.1.1 番茄斑萎病毒的分类  10
    1.1.2 番茄斑萎病毒的发生及分布  10
    1.1.3 番茄斑萎病毒的危害  10-11
    1.1.4 番茄斑萎病毒的危害症状  11-13
    1.1.5 番茄斑萎病毒的传播介体  13-14
    1.1.6 番茄斑萎病毒的病原形态  14-15
    1.1.7 番茄斑萎病毒的防治方法  15-16
    1.1.8 番茄斑萎病毒的检测方法  16-18
  1.2 实时荧光定量PCR技术  18-22
    1.2.1 实时荧光定量PCR技术原理  18-20
    1.2.2 实时荧光定量PCR的方法  20-21
      1.2.2.1 绝对定量  20
      1.2.2.2 相对定量  20-21
    1.2.3 实时荧光定量PCR的特点  21
    1.2.4 实时荧光定量PCR在植物病毒检测方面的应用  21-22
  1.3 本课题研究的目的和意义  22-23
2 番茄斑萎病毒的ELISA与RT-PCR检测  23-34
  2.1 实验材料  23
    2.1.1 病毒、菌株、质粒  23
    2.1.2 主要试剂  23
    2.1.3 主要溶液和培养基的配制见附表  23
    2.1.4 主要器材  23
  2.2 实验方法  23-29
    2.2.1 番茄斑萎病毒的接种纯化  23-24
      2.2.1.1 番茄斑萎病毒的接种  23
      2.2.1.2 番茄斑萎病毒的纯化  23-24
    2.2.2 番茄斑萎病毒的ELISA检测  24
    2.2.3 番茄斑萎病毒的分子生物学检测  24-29
      2.2.3.1 特异性引物的设计与合成  24-25
      2.2.3.2 病毒RNA的提取  25
      2.2.3.3 cDNA的合成  25
      2.2.3.4 常规PCR反应  25-26
      2.2.3.5 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测  26
      2.2.3.6 DNA的割胶回收  26-27
      2.2.3.7 感受态细胞的制备  27
      2.2.3.8 DNA产物的连接  27-28
      2.2.3.9 DNA产物的转化  28
      2.2.3.10 重组质粒的PCR筛选  28
      2.2.3.11 碱裂解法提取质粒  28-29
      2.2.3.12 重组质粒的PCR鉴定  29
      2.2.3.13 重组质粒酶切鉴定  29
      2.2.3.14 重组质粒测序鉴定  29
  2.3 番茄斑萎病毒检测结果与分析  29-34
    2.3.1 番茄斑萎病毒病毒的汁液摩擦接种症状  29-30
    2.3.2 ELISA检测结果  30
    2.3.3 分子生物学检测结果  30-32
    2.3.4 分析  32-34
3 番茄斑萎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立  34-44
  3.1 材料  34
  3.2 实时荧光定量PCR方法  34-37
    3.2.1 特异性引物的设计  34
    3.2.2 重组质粒的构建  34
    3.2.3 重组质粒的提取  34-35
    3.2.4 重组质粒浓度的测定  35
    3.2.5 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR反应参数  35
    3.2.6 标准曲线的绘制  35-36
    3.2.7 熔解曲线的建立  36
    3.2.8 灵敏度检测  36
    3.2.9 重复性检测  36
    3.2.10 样品的检测  36-37
  3.3 荧光定量PCR结果与分析  37-44
    3.3.1 番茄斑萎病毒重组质粒的浓度测定  37
    3.3.2 标准曲线的建立  37-38
    3.3.3 熔解曲线的结果  38
    3.3.4 灵敏度检测结果  38-39
    3.3.5 重复性检测结果  39-40
    3.3.6 样品检测结果  40-43
    3.3.7 分析  43-44
4 讨论与分析  44-47
5 结论  47-48
参考文献  48-52
附录  52-55
作者简介  55
攻读学位期间主要的研究成果  55-56
致谢  56

番茄斑萎病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

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