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草莓镶脉病毒编码蛋白对其启动子的调节作用及其亚启动子鉴定

作　者: 杨友志
导　师: 江彤
学　校: 安徽农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 草莓镶脉病毒 SVBV启动子病毒编码蛋白调节作用 SVBV亚启动子
分类号: S432.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）属于花椰菜花叶病毒科（Caulimoviridae）花椰菜花叶病毒属（Caulimovirus），SVBV为环状双链DNA病毒，基因组结构与花椰菜花叶病毒（CaMV）相似，包含7个ORF，也含有2个启动子。SVBV全长启动子P1位于ORF VI基因下游，与CaMV35S启动子的位置相同，驱动ORF I、ORF II、ORF III、ORF IV和ORF V基因的转录；ORF VI基因的转录由一个独立的启动子sP驱动，类似于CaMV的19S启动子。本研究进一步分析了SVBV2个启动子的驱动活性、驱动外源基因在植物中的表达模式以及驱动外源基因表达的稳定性。另外，本研究还分析了SVBV ORF I、ORF II、ORF III、ORF IV和ORF V基因编码的蛋白对全长启动子P1的调节作用。1SVBV各启动子驱动gus基因瞬间表达的组织化学染色将pINT P1、pINT P2、pINT P3、pINT P4、pINT P5和pINT121各表达载体电击转化的农杆菌分别注射本氏烟茎杆，组织化学染色并制备石蜡切片。显微观察发现，维管组织和部分皮层组织均能观察到蓝色位点，说明各启动子均能驱动gus基因在植物细胞中表达。2SVBV各启动子驱动gfp基因的瞬间表达和荧光活性观察将SVBV P1、SVBV P2、SVBV P3、SVBV P4和SVBV P5各启动子分别与载体pCHF3gfp基因前的35S启动子置换，获得植物表达载体pCHF P1、pCHF P2、pCHFP3、pCHF P4和pCHF P5，电击转化农杆菌，菌液分别注射本氏烟茎杆，制备茎杆注射区徒手切片。荧光显微镜观察发现，各植株维管组织均能观察到绿色荧光，说明各启动子均能驱动gfp基因在植物细胞中表达。从各切片的绿色荧光强度上来看，pCHFP1中gfp基因的表达水平要高于阳性对照pCHF3。注射未转化载体的农杆菌菌液，茎杆切片中几乎观察不到绿色荧光。3转基因普通烟gus基因mRNA的Real-time PCR检测Real-time PCR检测pINT P1和pINT121转基因普通烟gus基因的mRNA积累量，结果表明，pINT P1和pINT121转基因普通烟gus基因的mRNA积累量均显著高于非转基因普通烟，pINT P1转基因普通烟gus基因的mRNA积累量显著高于pINT121转基因普通烟，说明SVBV P1启动子的驱动活性很高，且超出35S启动子的驱动活性。4SVBV各ORF表达载体的构建及其对全长启动子P1调节作用构建SVBV中国分离物各ORF植物表达载体pBIN-ORF I、pBIN-ORF II、pBIN-ORF III、pBIN-ORF IV、pBIN-ORF V和pBIN-ORF VI，电击转化农杆菌，将含有各表达载体的农杆菌分别和含有表达载体pINT P1的农杆菌等量混合，瞬间浸润本氏烟叶片，荧光光度法定量分析gus表达活性，结果显示pBIN-ORF II和pBIN-ORFV分别与pINT P1共浸润时gus蛋白酶活性均显著高于pINT P1单独浸润，pBIN-ORFIV与pINT P1共浸润时gus蛋白酶活性显著低于pINT P1单独浸润，pBIN-ORF I、pBIN-ORF III、pBIN-ORF VI分别与pINT P1共浸润时gus蛋白酶活性与pINT P1单独浸润均无显著差异。结果表明，ORF II和ORF ORF V编码蛋白均能提高P1启动子的驱动活性，ORF I、ORF III、ORF VI编码蛋白对P1启动子驱动活性没有影响，ORF IV编码蛋白降低P1启动子的驱动活性。5SVBV亚启动子初步鉴定克隆SVBV中国分离物和美国分离物的亚启动子sP-cn和sP-us，分别置换pINT121载体gus基因上游的35S启动子，获得植物表达载体pINT sP-cn和pINTsP-us，电击转化农杆菌，瞬间浸润本氏烟叶片，荧光光度法测定结果表明，pINT sP-cn和pINT sP-us的平均相对gus活性极低，与未注射本氏烟相比没有显著差异，说明这2个亚启动子基本没有驱动活性。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
文献综述  10-22
  1 原核生物启动子  10-11
  2 真核生物启动子的结构模型  11-13
  3 高等植物启动子  13-18
    3.1 组成型启动子  13-14
    3.2 组织或器官特异性启动子  14-17
      3.2.1 根特异性启动子  14-15
      3.2.2 维管组织特异性启动子  15
      3.2.3 叶特异性启动子  15
      3.2.4 花特异性启动子  15-16
      3.2.5 果实特异型启动子  16-17
      3.2.6 种子特异型启动子  17
    3.3 诱导型启动子  17-18
      3.3.1 环境因素诱导型启动子  17-18
      3.3.2 激素诱导型启动子  18
  4 植物病毒启动子  18-20
    4.1 花椰菜花叶病毒属病毒  18-19
    4.2 双向启动子  19-20
    4.3 杆状病毒启动子  20
  5 启动子的人工改造  20
  6 花椰菜花叶病毒属病毒亚启动子研究现状  20-21
  7 病毒蛋白对启动子的影响  21-22
引言  22-23
材料与方法  23-35
  1 供试材料  23
  2 试验方法  23-35
    2.1 叶片总 DNA 的提取  23-24
    2.2 PCR 技术  24
    2.3 PCR 产物的克隆  24-26
    2.4 电击转化农杆菌  26-27
      2.4.1 电击转化感受态细胞制备  26-27
      2.4.2 表达载体转化农杆菌  27
    2.5 瞬间表达  27
    2.6 gus 活性分析  27-28
      2.6.1 gus 活性的组织化学染色  27
      2.6.2 蛋白活性的荧光光度测定  27-28
      2.6.3 蛋白质含量测定  28
      2.6.4 gus 荧光活性分析  28
    2.7 gfp 绿色荧光检测  28-29
    2.8 植物组织石蜡切片的制备  29
    2.9 Real-time PCR 检测  29-31
    2.10 SVBV 各启动子驱动 gfp 植物表达载体的构建  31-32
      2.10.1 植物表达载体的构建策略  31-32
      2.10.2 植物表达载体的构建和荧光光度观察  32
    2.11 SVBV 各 ORF 对全长启动子 P1 活性的调节作用  32-33
    2.12 亚启动子的构建  33-35
结果与分析  35-47
  1 SVBV 各启动子驱动 gfp 基因瞬间表达的荧光显微观察  35
  2 gus 基因瞬间表达的组织化学检测  35-37
  3 转基因普通烟中 gus 的 Real-time PCR 检测  37
  4 SVBV 编码各组分蛋白对全长启动子的调节作用  37-43
    4.1 SVBV 各开放阅读框植物表达载体的构建  37-42
    4.2 瞬间表达中 gus 荧光活性分析  42-43
  5 SVBV 亚启动子的鉴定  43-47
    5.1 SVBV 亚启动子序列相似性分析  43
    5.2 SVBV 亚启动子序列结构分析  43-45
    5.3 SVBV 亚启动子驱动 gus 基因表达载体的构建  45-46
    5.4 SVBV 亚启动子瞬间表达 gus 荧光活性分析  46-47
讨论  47-51
  1 SVBV 启动子鉴定  47
  2 病毒自身编码蛋白对全长启动子驱动活性的调节  47-49
  3 SVBV 亚启动子鉴定  49-51
结论  51-52
参考文献  52-59
附录 A 常用缓冲液及培养基配方法  59-62
附录 B 常用的抗生素和激素及使用浓度  62-63
附录 C 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器  63-65
致谢  65-66
作者简介  66

草莓镶脉病毒编码蛋白对其启动子的调节作用及其亚启动子鉴定

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