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费氏中华根瘤菌WGF03中TsT和SiR基因的功能鉴定

作　者: 郭美树
导　师: 申佩弘
学　校: 广西大学
专　业: 微生物学
关键词: 费氏中华根瘤菌 TsT基因 SiR基因硫代谢植株实验
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 35次
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内容摘要

硫是所有生物体必需的化学元素之一。它与氮相互作用,不仅能够作为生物体大分子结构组分,而且还能在新陈代谢中发挥特定作用。近年来的研究表明根瘤菌结瘤因子中的还原性末端,其硫化修饰决定了根瘤菌的宿主专一性。硫代硫酸硫转移酶由TsT基因编码,通过NCBI网站的Blast比对,与Rhizobium sp.NGR234在核苷酸水平上有95%的一致性,在氨基酸水平上有98%的相似性。为了鉴定这个基因的功能,我们通过pK18mobsacB同源双交换的方式,构建TsT基因的缺失突变体TsTI。TsT基因缺失突变后,在以硫代硫酸钠为唯一硫源的MM培养基中,突变菌株TsTI不能生长,但是可以利用硫酸盐、亚硫酸盐、半胱氨酸和甲硫氨酸为唯一的硫源正常生长。植株实验发现,TsT基因突变后,根瘤菌的结瘤时间推迟1天,竞争结瘤的能力下降,单株的结瘤数量也有所下降,同时在瘤重、植株干重和固氮酶活方面与野生型菌株S.fredii WGF03存在显著差异。亚硫酸还原酶是硫代谢途径中的一个酶,催化亚硫酸盐还原为硫化物。该酶由SiR基因编码,通过NCBI网站的Blast比对,发现该序列与Rhizobium sp.NGR234在核苷酸水平上有96%的一致性,在氨基酸水平上有98%的相似性。为了鉴定这个基因的功能,我们通过pK18mobsacB同源双交换的方式,构建SiR基因的缺失突变体SiRI。SiR基因缺失突变后,在以硫酸钠、亚硫酸钠为唯一硫源的MM培养基中,突变菌株SiRI不能生长,而野生型菌株WGF03和互补菌株CSIRI生长正常,但是突变菌株SiRI可以利用硫代硫酸盐、半胱氨酸和甲硫氨酸为唯一的硫源的正常生长。植株实验也证实,SiR基因缺失突变后,根瘤菌的结瘤时间推迟2天,竞争结瘤的能力下降,单株的结瘤数量也有所下降,同时在瘤重、植株干重和固氮酶活方面与野生型菌株S.fredii WGF03存在显著差异。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-12
第一章文献综述  12-29
  1.1 生物固氮  12-13
  1.2 根瘤菌与豆科植物的共生关系  13-22
    1.2.1 根瘤菌的形态、生理、营养和生态  14-15
    1.2.2 大豆根瘤菌的有效性  15-16
    1.2.3 根瘤菌的结瘤过程  16-17
    1.2.4 结瘤基因及其表达调控  17-19
    1.2.5 根瘤的形成过程  19-22
  1.3 硫代谢  22-26
    1.3.1 微生物无机硫的代谢  22-25
    1.3.2 根瘤菌的硫代谢  25-26
  1.4 国内外根瘤菌的研究进展  26-28
    1.4.1 国外根瘤菌的研究进展  26-27
    1.4.2 国内根瘤菌和生物固氮的研究进展  27
    1.4.3 生物固氮研究展望  27-28
  1.5 研究课题的目的  28-29
第二章材料和方法  29-46
  2.1 菌株和质粒  29-30
  2.2 培养基、抗生素与菌株生长条件  30-32
    2.2.1 大肠杆菌(E.coli)使用的培养基  30-31
    2.2.2 根瘤菌(S.fredii)使用的培养基  31-32
    2.2.3 抗生素  32
    2.2.4 菌株的生长和保存条件  32
  2.3 试剂  32-33
    2.3.1 酶和试剂  32
    2.3.2 主要仪器  32-33
  2.4 DNA分子操作技术  33-37
    2.4.1 根瘤菌(S.fredii)总DNA的提取  33
    2.4.2 质粒DNA的提取  33-34
    2.4.3 琼脂糖凝胶电泳  34-35
    2.4.4 DNA片段的分离与回收  35
    2.4.5 DNA片段的纯化  35-36
    2.4.6 DNA的酶切  36
    2.4.7 DNA的连接  36-37
  2.5 PCR(聚合酶链式反应)扩增DNA  37-38
    2.5.1 引物的设计  37
    2.5.2 模板制备  37
    2.5.3 PCR反应体系  37-38
    2.5.4 PCR反应程序  38
  2.6 转化  38-39
    2.6.1 化学法制备感受态细胞  38-39
    2.6.2 连接产物的转化  39
  2.7 三亲本接合  39-40
  2.8 缺失突变株的构建原理  40-41
  2.9 功能互补菌株的构建过程  41-42
  2.10 胞外多糖的检测  42-43
  2.11 根瘤菌生长曲线的测定  43
    2.11.1 在TY培养基和YMB培养基中生长曲线的测定  43
    2.11.2 MM液体培养基中的生长曲线的测定  43
  2.12 大豆植株实验  43-46
第三章 TsT基因缺失研究的结果与分析  46-61
  3.1 野生型菌株总DNA的提取  46-47
  3.2 PCR扩增旁侧序列片段  47-48
  3.3 突变体TsTI的构建  48-49
  3.4 缺失突变体的互补  49-50
    3.4.1 互补片段的扩增  49
    3.4.2 互补菌株的筛选和验证  49-50
  3.5 TsT基因测序结果生物信息学分析  50-51
  3.6 TsT基因的缺失突变菌株及互补菌株的功能验证  51-55
    3.6.1 突变菌株TsTI在TY培养基上的生长情况  51-53
    3.6.2 突变菌株TsTI在YMA培养基上的生长情况  53-54
    3.6.3 胞外多糖检测  54-55
  3.7 硫源的利用情况  55-58
  3.8 植株实验  58-61
    3.8.1 植株的结瘤时间检测  58-59
    3.8.2 竞争结瘤的检测  59-60
    3.8.3 共生结瘤固氮效应检测  60-61
第四章 SiR基因缺失研究的结果与分析  61-77
  4.1 野生型菌株总DNA的提取  61-62
  4.2 PCR扩增旁侧序列片段  62-63
  4.3 突变体SiRI的构建  63-64
  4.4 缺失突变体的互补  64-66
    4.4.1 互补片段的扩增  64-65
    4.4.2 互补菌株的筛选和验证  65-66
  4.5 SiR基因测序结果生物信息学分析  66-67
  4.6 SiR基因的缺失突变菌株及互补菌株的功能验证  67-70
    4.6.1 突变菌株SiRI在TY培养基上的生长情况  67-68
    4.6.2 突变菌株SiRI在YMA培养基上的生长情况  68-70
    4.6.3 胞外多糖检测  70
  4.7 硫源的利用情况  70-74
  4.8 植株实验  74-77
    4.8.1 植株的结瘤时间检测  74-75
    4.8.2 竞争结瘤的检测  75-76
    4.8.3 共生结瘤固氮效应检测  76-77
第五章总结与讨论  77-81
  5.1 总结  77-78
  5.2 讨论  78-80
  5.3 本工作的有待深入的内容  80-81
参考文献  81-92
致谢  92-94
攻读硕士学位期间发表的论文  94

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