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构巢曲霉磷酸核糖焦磷酸合成酶（PRS）家族的生物学功能研究及其对酶活力的协同调控作用

作　者: 魏雯帆
导　师: 陆玲
学　校: 南京师范大学
专　业: 微生物学
关键词: PRS 人类疾病相关基因构巢曲霉
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)在体内催化五磷酸核酮糖(R-5-P)和三磷酸腺苷(ATP)合成磷酸核糖焦磷酸(PRPP).其产物PRPP参与体内的多种代谢途径,例如磷酸戊糖途径,嘌呤和嘧啶核苷酸的从头合成和补救途径以及组氨酸和色氨酸的合成。在人体中,PRS基因的多种突变形式与人的许多神经性疾病相关,但是其致病机理尚不清楚。由于构巢曲霉是多细胞真核生物,在同缘关系上较单细胞的酵母与人类的同源关系更为接近,且具有结构简单、遗传背景清楚、遗传可操作性强等特征,因此常被用来作为研究与人类疾病相关基因功能的重要模式生物。本研究以构巢曲霉为模式生物研究PRS蛋白家族在细胞发育过程中的功能。已有研究表明酿酒酵母中的PRS蛋白家族在酿酒酵母中存在5个同源蛋白,且以形成两个功能互补的复合体的形式发挥作用,通过同源比对(BLAST),我们发现在构巢曲霉中存在三个PRS蛋白的同源蛋白。根据它们与酿酒酵母PRS1-5蛋白的同源关系,我们将其命名为AnPRS1, AnPRS2和AnPRS3.其中AnPRS2这个蛋白与人类疾病相关蛋白PRPS1(Homo Sapiens)的同一性(idendity)高达66.7%,且包含所有与疾病相关的突变位点。在我们实验室前期筛选构巢曲霉控制胞质分裂的SIN途径(Septation Initiation Network)的反向调节子的研究中也发现,构巢曲霉中PRS酶活力的降低可以抑制SIN途径下游关键激酶SEPH的缺失表型。我们对编码这三个蛋白的基因分别进行敲除和启动子替换实验,发现Anprs1的敲除或抑制表达对菌丝的生长发育影响不大,但是对Anprs2或Anprs3的敲除或抑制表达均会导致构巢曲霉孢子不能萌发,表现出致死基因的表型。此外,在构巢曲霉的不同生长阶段关闭Anprs1,2,3发现,ANPRS2在菌丝的整个生长阶段都是必需的,而Anprs1和Anprs3在菌丝生长阶段的关闭都不会对菌株发育产生影响。我们通过条件启动子高表达Anprs1,2,3发现,高表达Anprs2会导致胞质分裂的失败以及产孢不能发生,高表达Anprs3和Anprs1均会导致产孢和胞质分裂的一定缺陷。为了进一步弄清楚AnPRS1,2,3三个蛋白的细胞学功能,我们分别测定了抑制三个蛋白表达情况下的PRS酶活,发现这三个蛋白对酶活的贡献是不同的,在抑制ANPRS2表达的情况下,PRS总酶活只有野生型的5%,而抑制ANPRS3表达,其PRS总酶活是野生型的25%,抑制ANPRS1表达可使酶活维持在野生型的80%。实时定量PCR(Real-time-qPCR)结果显示Anprs1,2,3这三个基因的表达水平在菌丝的生长阶段也不同,以Anprs2的表达水平最高,Anprs3次之,Anprs1最少。这些结果都建议Anprs2在构巢曲霉的生长发育过程中扮演着最为重要的角色。综上所述,AnPRS2作为人类疾病相关蛋白HumanPRPS1的同源蛋白,在构巢曲霉的生长发育过程中同样发挥着重要作用,对其抑制和高表达情况下的细胞学表型分析,将有助于我们理解因为人类PRPS1突变而造成疾病的机制。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-11
第1章绪论  11-20
  1.1 磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)的研究进展  11-13
    1.1.1 HumanPRPS1突变造成的人类遗传疾病  11-12
    1.1.2 酿酒酵母中PRS家族蛋白以形成复合体的发挥作用  12-13
    1.1.3 PRS家族蛋白在细菌中的研究  13
  1.2 在构巢曲霉中研究胞质分裂的意义及研究现状  13-15
  1.3 构巢曲霉中PRS蛋白参与调节胞质分裂  15-18
    1.3.1 构巢曲霉中SIN途径反向调节子的筛选  15-17
    1.3.2 PRS家族蛋白作为SEPH的反向调节子调节胞质分裂  17-18
  1.4 本课题的研究内容、思路和方法  18-20
    1.4.1 研究内容  18
    1.4.2 研究思路  18
    1.4.3 研究方法  18-20
第2章构巢曲霉ANPRS蛋白家族的信息学分析和基因敲除实验以及初步的表型研究  20-31
  2.1 材料与方法  23-28
    2.1.1 菌种、质粒及培养条件  23
    2.1.2 试剂与仪器  23
    2.1.3 引物设计  23-26
    2.1.4 融合PCR  26-27
      2.1.4.1 扩增全长的各组成片段  26
      2.1.4.2 三片段连接FusionPCR,产物纯化和质量评估  26-27
    2.1.5 构巢曲霉原生质体的制备及转化  27
    2.1.6 重组子的初步筛选  27
    2.1.7 转化子的进一步PCR诊断  27-28
  2.2 实验结果  28-29
    2.2.1 转化子的初步表型鉴定  28
    2.2.2 转化子的诊断PCR结果  28-29
    2.2.3 Anprs1,2,3敲除菌株的细胞学表型  29
  2.3 讨论  29-31
第3章构巢曲霉ANPRS蛋白家族条件菌株的构建、筛选及鉴定  31-41
  3.1 材料与方法  32-37
    3.1.1 菌种及培养条件  32
    3.1.2 试剂与仪器  32
    3.1.3 A.nidulans基因组DNA的提取  32-33
    3.1.4 alcA(p)：：GFP-Anprs1,2,3同源整合菌株的构建  33-34
    3.1.5 重组子(发生GeneReplacement的转化子)的初步筛选  34-35
    3.1.6 条件菌株的Western验证  35-36
      3.1.6.1 构巢曲霉蛋白样品的制备  35
      3.1.6.2 SDS-PAGE电泳  35-36
      3.1.6.3 样品的印记(转膜)  36
      3.1.6.4 免疫检测  36
    3.1.7 alc：：GFP：：AnPRS1,2,3在酒精启动子调控下的动态定位  36-37
  3.2 实验结果  37-40
    3.2.1 重组子的初步表型鉴定  37-38
    3.2.2 重组子的进一步PCR鉴定  38-39
    3.2.3 条件菌株的western验证  39
    3.2.4 AnPRS1,2,3三个蛋白的细胞学定位  39-40
  3.3 讨论  40-41
第4章构巢曲霉ANPRS蛋白家族的细胞学功能研究  41-49
  4.1 材料与方法  41-43
    4.1.1 菌种及培养条件  41-42
    4.1.2 试剂与仪器  42
    4.1.3 显微观察  42
    4.1.4 孢子计数  42-43
  4.2 实验结果  43-47
    4.2.1 AnPRS2与AnPRS3对孢子的萌发都是必需的  43-44
    4.2.2 AnPRS2在菌丝生长中也是必需的,AnPRS3却不是  44-45
    4.2.3 高表达AnPRS2抑制胞质分裂及无性产孢  45-47
  4.3 讨论  47-49
    4.3.1 AnPRS2在构巢曲霉的整个生长阶段都是必需的,AnPRS3只是在孢子萌发阶段是必需的  47
    4.3.2 AnPRS家族对胞质分裂过程的抑制作用  47-49
第5章构巢曲霉ANPRS蛋白家族的转录水平和酶活特性以及蛋白相互作用的分析  49-58
  5.1 材料与方法  49-53
    5.1.1 菌种及培养条件  49
    5.1.2 试剂与仪器  49-50
    5.1.3 实时荧光定量PCR测定Anprs1,2,3在构巢曲霉发育各阶段表达量的差别  50-52
      5.1.3.1 构巢曲霉总RNA的提取  50
      5.1.3.2 反转录PCR  50-51
      5.1.3.3 Real-time qPCR  51-52
      5.1.3.4 数据处理  52
    5.1.4 PRS酶活力的测定  52-53
    5.1.5 酵母双杂交实验  53
  5.2 结果  53-57
    5.2.1 Anprs1,2,3的转录水平在菌丝发育的不同阶段各不相同  53-54
    5.2.2 AnPRS1,2,3三个蛋白对PRS的酶活贡献各不相同  54-55
    5.2.3 酵母双杂交实验证实构巢曲霉中AnPRS1,2,3相互之间存在物理相互作用  55-57
  5.3 讨论  57-58
第6章结论  58-60
  6.1 PRS蛋白家族在构巢曲霉中所发挥的生物学功能  58
  6.2 ANPRS2在调节构巢曲霉PRPP合成酶活性中扮演核心角色  58-60
参考文献  60-63
附录  63-64
  附录A 硕士期间获奖情况  63
  附录B 硕士期间参与课题  63
  附录C 硕士期间发表论文情况  63-64
致谢  64

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