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嗜盐紫色硫细菌耐盐机制与光合色素研究

作　者: 崔小华
导　师: 杨素萍
学　校: 山西大学
专　业: 微生物学
关键词: 紫色硫细菌耐盐机制光合色素奥氏酮稳定性
分类号: Q93
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

紫色硫细菌是不产氧光合细菌中的一个生境独特的类群,大约出现在3.5Ga年前,是深入理解生命起源、自然界碳氮硫在物质循环中的作用、以及揭示不产氧光合作用机理的良好模型生物,在去除污染水体有机物、氮和磷以及有毒物质硫化物中也具有重要的应用价值。因该类群大多数种类生境特殊,较难获得纯培养物、菌种生长不良易于丢失,因此对其研究远不如紫色非硫细菌深入和广泛。奥氏酮(Okenone)类胡萝卜素是迄今发现的最古老的生物标志之一,已被用作研究地球进化和环境适应机制的一个有效工具,目前发现它仅出现在紫色硫细菌的15个种类中。本课题组从青岛东风盐场分离获得一株含有独特光合色素-奥氏酮的嗜盐紫色硫细菌Marichromatium sp.283-1。本文对该菌株的生物学特性、耐盐特性和耐盐机制、光合色素组份分析、环境因子对色素合成的影响、尤其是Okenone的特性和理化性质进行了系统研究,研究结果显示出Okenone类胡萝卜素性能稳定,耐热性、抗光性良好,高色价且色泽鲜艳,具有良好的特性,因此本文又进一步对Okenone的产量进行了优化。主要研究结果如下：1.生物学特性研究结果表明,紫色硫细菌Marichromatium sp.283-1对氧气敏感,最高能够耐受150g/L NaCl,1.8g/L Na2S.9H2O,7.7g/L NaNO2,能在pH6-9,温度15～45℃,光照强度100-8000Lux的范围内生长。不同的碳源、氮源、盐度、pH、光照、温度对菌体形态和胞内硫粒数量都有影响。高盐胁迫下细胞形态多样,体积增大,比表面积减小；在碱性和低温环境中细胞呈棒状而且体积较大,胞内积累较多的硫粒；高温下,细胞呈长杆状,体积变大,胞内积累较多硫粒。2. Marichromatiun sp.283-1是一株厌氧中度嗜盐紫色硫细菌,对其耐盐特性和耐盐机制进行了初步研究。结果表明随着盐度增加菌株283-1生长的延滞期延长,对Na+有专一依赖性,而对C1-依赖性较弱；它主要通过在胞内积累相容性溶质甜菜碱来对抗胞外渗透压力,胞内甜菜碱的含量随培养基NaCl浓度的增加而增加,2.0mol/L NaCl浓度时胞内甜菜碱含量可达到156.4mg/g细胞干重。外源添加甜菜碱可以明显提高菌株283-1耐盐生长的能力。因此,菌株283-1是通过胞内积累甜菜碱来调节细胞内外渗透压平衡,外源添加甜菜碱可以明显提高该菌株对盐的耐受能力。3.为了解决紫色硫细菌生物量普遍较低的问题,对其生长培养基进行了优化。采用单因子试验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验及中心组合设计响应面分析,研究了乙酸钠、碳酸氢钠、氯化铵、硫化钠、硫酸镁和无机盐6个因子对菌株283-1生物量的影响。结果表明,乙酸钠和硫化钠是影响该菌株生物量的主要因素,并获得了最佳培养基配方。优化后菌株生长速率提高,延迟期缩短,生物量提高了6倍,并且结果与理论预测值相近。4.采用丙酮甲醇法提取菌体色素,通过UV-VIS、TLC、HPLC、MS和图像灰度分析等方法全面分析了该菌株的光合色素。结果表明：光照厌氧条件下,菌株283-1主要积累8种光合色素,包括BChl aGG、BChl aDHGG、BChl aTHGG和BChl ap4种细菌叶绿素,1种BPhe和OH-R.g-ketoⅠ、R.g-ketoⅢ和Okenone3种类胡萝卜素,其中细菌叶绿素BChl aP和类胡萝卜素Okenone含量最高,分别占总色素含量的39.6%和47.4%。同时建立了菌株283-1全色素的TLC和HPLC指纹图谱,这两种指纹图谱分析方法均能进行光合色素的快速分析,适合于紫色硫细菌Okenone系合成途径中和BChl a合成途径中主要积累色素组分和含量变化规律的研究。5.利用构建的指纹图谱研究了环境因子光照、温度和盐度对菌株色素合成的影响,结果表明：光照强度的变化主要影响类胡萝卜素和细菌叶绿素单位细胞的含量,对色素组份影响不明显；温度的对色素组份影响较大,低温(20℃)时,积累的类胡萝卜素主要是Okenone,TLC指纹图谱未检测到另外两种类胡萝卜素。在30℃,2000Lux时,细菌叶绿素和类胡萝卜素单位细胞含量最高；而在45℃,5000Lux时,细菌叶绿素和类胡萝卜素单位细胞含量最低。盐度变化不影响菌株的色素组份,但对各组分的相对含量影响较大。高盐(11%NaCl)下,BChl ap和BPhe的积累量明显增加,尤其是BChl ap的相对含量增加约70%；但是,OH-R.g-ketoI的积累量下调了40%。低盐(1%NaCl)下,BPhe和Okenone的相对含量明显上调。6. Okenone类胡萝卜素作为地球进化过程一种重要的生物标志物。菌株283-1胞内可积累大量的Okenone系类胡萝卜素。在紫色硫细菌Marichromatium sp.283-1光合色素组成分析的基础上,通过丙酮甲醇提取、皂化、TLC和HPLC分析、制备得到纯化的Okenone类胡萝卜素,并研究了光(包括紫外线)、温度、pH、金属离子、氧化剂、还原剂、自由基和食品添加剂等对Okenone类胡萝卜素稳定性的影响。结果表明,在暗处、1000Lux光照强度和4℃、30℃、50℃的条件下,Okenone具有很好的稳定性,有很高的耐光和耐热能力；强酸和强碱对Okenone破坏较大；对食品添加剂和多数金属离子稳定,但是Fe3+、Mg2+、Al3+和Cu2+的影响较大,尤其是Fe3+,因此,Okenone存放时应避免与这些物质接触。Okenone类胡萝卜素吸收光谱形状和精细结构受到有机溶剂极性的影响,当溶剂由非极性转变为极性时,其精细结构减弱或消失,吸收峰趋于平滑。Okenone在石油醚溶液中呈鲜艳的橙红色,色价为40000。Okenone对紫外辐射具有较强的吸收作用,因此它可通过牺牲自己起到防护作用。以[DPPH·]作为自由基检测试剂,测定了该类胡萝卜素清除[DPPH·]自由基能力,结果表明它具有抗氧化生物活性,EC50=0.022mg/mL。7.在优化了生物量的基础上,继续通过响应面分析法研究了培养基中5种无机盐和微量元素对菌株283-1Okenone类胡萝卜素积累的影响。结果表明：培养基中微量元素、碳酸氢钠和磷酸二氢钾显著影响Okenone类胡萝卜素在胞内的积累,通过Behnken Box试验设计,得到了最佳培养基配方。在优化培养基中,Okenone产量由原来的1.454mg/L提高到了2.926mg/L,提高了101.2%

全文目录

中文摘要  12-15
ABSTRACT  15-19
第一章绪论  19-36
  1.1 紫色硫细菌概述  19-22
    1.1.1 紫色硫细菌的系统分类  19
    1.1.2 紫色硫细菌的生理生态特征  19-21
    1.1.3 紫色硫细菌的应用  21-22
  1.2 中度嗜盐菌概述  22-23
    1.2.1 中度嗜盐菌的耐盐机制  22-23
    1.2.2 中度嗜盐菌的应用  23
  1.3 光合色素概述  23-31
    1.3.1 类胡萝卜素  24-26
    1.3.2 细菌叶绿素  26-28
    1.3.3 光合色素分析方法  28-31
  1.4 影响微生物色素合成的因素  31-32
    1.4.1 培养基成分对微生物色素合成的影响  31
    1.4.2 环境因素对微生物色素合成的影响  31-32
    1.4.3 金属离子和无机盐对微生物色素合成的影响  32
    1.4.4 添加有机物对微生物色素合成的影响  32
  1.5 本课题研究目的和意义  32-36
第二章嗜盐紫色硫细菌Marichromatium sp.283-1的生物学特性  36-45
  2.1 材料与方法  36-38
    2.1.1 材料  36
    2.1.2 方法  36-38
  2.2 结果  38-43
    2.2.1 细胞形态  38
    2.2.2 NaCl耐受性  38
    2.2.3 氧气敏感性测试  38-39
    2.2.4 碳源、氮源和硫化物利用能力  39
    2.2.5 硫化物的耐受能力  39-40
    2.2.6 亚硝酸钠的耐受能力  40
    2.2.7 环境条件对菌株生长的影响  40-41
    2.2.8 不同条件下283-1细胞形态  41-43
  2.3 结论  43-45
第三章嗜盐紫色硫细菌Marichromatium sp.283-1的耐盐机制  45-52
  3.1 材料与方法  45-47
    3.1.1 材料  45-46
    3.1.2 方法  46-47
  3.2. 结果  47-50
    3.2.1 不同NaCl浓度对菌株生长的影响  47-48
    3.2.2 不同种类阴阳离子对菌株283-1生长的影响  48
    3.2.3 不同渗透压冲击对菌株283-1耐盐生长的影响  48-49
    3.2.4 外加相容性溶质对菌株283-1耐盐生长的影响  49
    3.2.5 不同盐浓度下菌株283-1胞内游离氨基酸的积累  49-50
    3.2.6 不同盐浓度下菌株283-1胞内甜菜碱的积累  50
  3.3 结论  50-52
第四章嗜盐紫色硫细菌Marichromatium sp.283-1生长培养基优化  52-59
  4.1 材料与方法  52-54
    4.1.1 材料  52-53
    4.1.2 方法  53-54
  4.2 结果与分析  54-57
    4.2.1 单因素试验  54
    4.2.2 Plackett-Burman试验  54-55
    4.2.3 最陡爬坡试验  55
    4.2.4 中心组合试验和响应面分析  55-57
    4.2.5 验证试验  57
  4.3 结论  57-59
第五章嗜盐紫色硫细菌Marichromatium sp.283-1光合色素分析及环境因子对色素合成的影响  59-72
  5.1 材料与方法  59-61
    5.1.1 材料  59-60
    5.1.2 方法  60-61
  5.2 结果与分析  61-70
    5.2.1 活细胞吸收光谱  61-62
    5.2.2 色素的提取和含量测定  62
    5.2.3 TLC色素指纹图谱分析和灰度分析  62-63
    5.2.4 TLC色素指纹光谱学特征  63-64
    5.2.5 HPLC色素指纹图谱  64-65
    5.2.6 MS分析  65
    5.2.7 色素组分定性分析  65-66
    5.2.8 环境因子对色素合成的影响  66-70
  5.3 结论  70-72
第六章嗜盐紫色硫细菌生物标志物Okenone的分离鉴定和性质研究  72-86
  6.1 材料与方法  72-75
    6.1.1 材料  72-73
    6.1.2 方法  73-75
  6.2 结果与分析  75-84
    6.2.1 Okenone类胡萝卜素的制备和鉴定  75
    6.2.2 Okenone类胡萝卜素色价和溶剂效应  75-77
    6.2.3 光照强度对Okenone类胡萝卜素的影响  77-79
    6.2.4 Okenone类胡萝卜素的热稳定性  79
    6.2.5 酸碱对Okenone类胡萝卜素稳定性的影响  79-82
    6.2.6 金属离子、食品添加剂和氧化还原剂对Okenone稳定性影响  82
    6.2.7 Okenone类胡萝卜素抗紫辐射能力  82-83
    6.2.8 Okenone类胡萝卜素清除[DPPH·]自由基能力  83-84
  6.3 结论  84-86
第七章响应面法优化Okenone类胡萝卜素发酵培养基  86-96
  7.1 材料与方法  87-88
    7.1.1 材料  87
    7.1.2 方法  87-88
  7.2 结果与分析  88-94
    7.2.1 Plackett-Burman试验  88-89
    7.2.2 最陡爬坡试验  89-90
    7.2.3 Box-Benhken试验设计和响应面分析  90-93
    7.2.4 验证试验  93-94
  7.3 结论  94-96
第八章主要结论、创新点与研究展望  96-97
参考文献  97-114
攻读学位期间取得的研究成果  114-115
致谢  115-116
个人简况及联系方式  116-118

嗜盐紫色硫细菌耐盐机制与光合色素研究

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