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大豆快生根瘤菌共生基因的遗传分化及快慢生根瘤菌对土壤微生物的影响比较

作　者: 郭慧娟
导　师: 陈文新；田长富
学　校: 中国农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 根瘤菌共生相关基因遗传分化微生物多样性竞争结瘤能力
分类号: Q939.114
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

无论是在酸性、碱性还是中性土壤中,目前国际上所使用的大豆根瘤菌剂主要是慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)。但在偏碱性土壤中,中华根瘤菌属(Sinorhizobium)为与大豆共生的优势菌,且生长速度比慢生根瘤菌快,发酵成本低。虽然大豆快生根瘤菌在偏碱性土壤中有着广阔的应用前景,但其与不同大豆品种的共生特异现象限制了其在农业生产中的应用。本论文针对分离自新疆和黄淮海两个生态区的60株大豆快生根瘤菌代表菌株,分析了3个核心基因(SMc00019, truA, thrA)及不同复制子上的16个共生基因(chromosome:bacA, purL, nodM, gcvT, cysD, cobO, nodE; pSymB:exoA, exoY, phnC; pSymA:nodC, nodS, y4wE, nodDl, nodD2, rhcJ)的遗传分化和进化机制。这些菌株可以划分为5个种群,且不同的种群在不同的复制子上都有不同程度的遗传分化：(1) Sinorhizobium fredii种内多样性最高且分布最广,而S. sojae种内多样性最低且地理分布范围很窄；(2)对于染色体上的核心基因和共生基因及pSymB上的共生基因,基因间重组主要发生在种内而在种间很少,而pSymA上的共生基因可以在不同种群或菌株间进行水平基因转移,且pSymA上共生基因的核苷酸多态性水平及重组值低于染色体和pSymB上的基因。由此可见,大豆快生根瘤菌不同复制子上共生相关基因的进化历史是不相同的,这为逐步揭示大豆快生根瘤菌与大豆品种共生差异现象的形成机制打下了基础。在碱性土壤中,能否用大豆快生根瘤菌来代替慢生根瘤菌做为根瘤菌剂呢?本论文比较了分离自黄淮海地区的辽宁慢生根瘤菌B. liaoningense和费氏中华根瘤菌S. fredii在碱性土壤中的竞争结瘤能力及对土壤微生物群落的影响。利用基于rpoB种水平的高通量测序分析发现：(1)大豆开花初期土壤中的微生物群落α-和β-多样性在4个处理(H1,不接种不施肥对照；H2,接种S. fredii; H3,接种B. liaoningense; H4,不接菌施肥对照)比播种前相应的各处理(Q1-Q4)都发生了变化；(2)开花初期与播种前相比OTU百分比增加的有：Thiorhodovibrio, Thioalkalivibrio, Thauera, Sphingomonas, Sphingobium, Bradyrhizobium。降低的有：Nitrobacter, Mesorhizobium, Agrobacterium;(3) Sinorhizobium属在接种S.fredii处理前后的OTU百分比并没有明显变化,但在接种B. liaoningense的处理的开花初期比播种前高出了2倍；Bradyrhizobium属在接种B.liaoningense的处理在开花初期比播种前高出1.6倍,且P值(0.075)也接近显著性临界值；(4)尽管所检测土壤中含有丰度较高的Bradyrhizobium,却并没有发现已知的能够与大豆结瘤的Bradyrhizobium根瘤菌种。但B. liaoningense可以使S. fredii种群数量升高5.6倍(P=0.058)；另一方面对开花期大豆根瘤的占瘤率分析表明：在不接菌不施肥对照、施肥对照和接种S. fredii的处理中全部根瘤都是由S. fredii形成的,接种B. liaoningense的处理中S. fredii的占瘤率也高达94.1%。可见,在碱性土壤中接种根瘤菌B. liaoningense竞争不过土著S. fredii。因此建议在碱性土壤中接种竞争结瘤能力较强的S. fredii作为大豆根瘤菌剂,但是必须考虑S. fredii菌株的遗传分化与当地大豆品种的匹配性。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
图表清单  10-12
缩写词  12-14
第一章文献综述  14-36
  1.1 引言  14-15
  1.2 根瘤菌-豆科植物共生体系的建立过程  15-19
  1.3 根瘤菌多样性研究进展  19-22
    1.3.1 根瘤菌表型多样性研究  19-20
    1.3.2 根瘤菌遗传多样性研究  20-21
    1.3.3 根瘤菌共生多样性研究  21-22
    1.3.4 根瘤菌多样性研究展望  22
  1.4 根瘤菌进化历史的研究  22-27
    1.4.1 生物进化的基本概念  22-23
    1.4.2 进化机制  23-24
    1.4.3 根瘤菌的进化  24-25
    1.4.4 基于基因组和比较基因组学研究根瘤菌进化历史  25-27
  1.5 宏基因组学方法在微生物多样性研究上的应用与进展  27-31
    1.5.1 宏基因组学概念的提出  27-28
    1.5.2 基于宏基因组学的微生物生态学研究方法  28-29
    1.5.3 宏基因组学的研究过程  29-30
    1.5.4 宏基因组学的应用  30-31
  1.6 大豆接种根瘤菌剂的研究进展  31-33
    1.6.1 接种根瘤菌剂的必要性  31-32
    1.6.2 影响大豆根瘤菌剂有效性的因素  32-33
  1.7 立题依据及目的  33-35
  1.8 技术路线  35
  1.9 项目资助  35-36
第二章大豆快生根瘤菌共生基因的遗传分化  36-78
  2.1 实验材料  36-39
    2.1.1 供试菌株的分离信息  36-39
    2.1.2 培养基  39
  2.2 分析方法  39-47
    2.2.1 根瘤菌DNA的提取  39-40
    2.2.2 核心基因与共生基因PCR扩增及测序  40-41
    2.2.3 PCR简并引物设计  41-44
    2.2.4 核苷酸序列分析  44
    2.2.5 系统发育学分析  44-45
    2.2.6 各基因序列多态性分析  45
    2.2.7 遗传分化及基因流  45
    2.2.8 Structure分析  45-46
    2.2.9 基因重组事件分析  46-47
    2.2.10 重组断点RDP分析  47
    2.2.11 基于McDonald-Kreitman(MK)中性检验的分子水平自然选择  47
  2.3 结果与分析  47-73
    2.3.1 持家基因thrA系统发育分析  47-49
    2.3.2 三个持家基因(SMc00019,truA,thrA)系统发育分析  49
    2.3.3 三个复制子共生基因系统发育分析  49-57
    2.3.4 不同基因核酸多态性的研究  57-58
    2.3.5 基因流与遗传分化分析  58-61
    2.3.6 种群结构分析  61-63
    2.3.7 Sinorhizobium种群进化过程中的重组事件  63-67
    2.3.8 核心基因与共生基因最大似然树SH检验结果  67-68
    2.3.9 基因重组断点的研究  68-70
    2.3.10 分子水平的自然选择  70-73
  2.4 讨论  73-78
    2.4.1 与大豆共生结瘤的Sinorhizobium划分为五个种群  73-74
    2.4.2 依赖于复制子的共生基因的进化  74-78
第三章快慢生根瘤菌对土壤微生物的影响比较  78-114
  3.1 材料和方法  78-86
    3.1.1 大豆品种及菌株  78
    3.1.2 培养基和试剂  78-79
    3.1.3 试验田接种实验  79
    3.1.4 小区采样  79-80
    3.1.5 土壤总DNA的提取  80-81
    3.1.6 土壤DNA rpoB基因的扩增  81
    3.1.7 根瘤菌占瘤率测定  81-83
    3.1.8 环境微生物群落多样性分析  83-86
  3.2 结果  86-108
    3.2.1 土壤DNA提取结果  86-87
    3.2.2 rpoB基因的扩增  87
    3.2.3 开花初期瘤数统计及根瘤中根瘤菌的分离  87-89
    3.2.4 土壤环境因子指标测定  89-92
    3.2.5 α-多样性分析  92-101
    3.2.6 β-多样性分析  101-106
    3.2.7 土壤与根瘤中的根瘤菌属与模式菌定种结果  106-108
  3.3 分析与讨论  108-114
结论与展望  114-116
参考文献  116-132
致谢  132-134
附录  134-150
个人简历  150

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