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核基质结合蛋白SATB2调控~Gγ和~Aγ珠蛋白基因表达和空间靠近

作　者: 周立全
导　师: 刘德培
学　校: 北京协和医学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: SATB2 核基质结合蛋白 γ珠蛋白 染色质空间结构
分类号: Q75
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


真核基因表达调控是发生在细胞核内的一个复杂而精细的过程,对维持细胞乃至机体的正常生理功能起到至关重要的作用。其中,染色质水平的调控作为真核基因表达调控的一种重要方式日益受到人们的重视。核基质结合蛋白是一类重要的真核基因转录调控因子,它们定位到细胞核内的核基质结构上,与大量调控相关的转录因子和酶类形成复合物,并参与基因的活化或抑制。目前已经发现的核基质结合蛋白有很多,包括SAF-A, Cux/CDP, SATB1, SATB2等。其中,SATB1和SATB2是属于SATB家族的一类经典的核基质结合蛋白,它们可以结合到基因调控序列的AT富含区从而调控染色质的结构。珠蛋白基因簇的表达调控是研究真核基因转录调控的经典模型。人珠蛋白基因簇由上游的一系列超敏位点组成的基因座控制区(locus control region, LCR)和下游的胚胎期(ε)、胎儿期(γ)和成年期(β)珠蛋白基因组成。在珠蛋白基因簇活化时上游基因座控制区会与下游活性基因空间靠近形成活性染色质中心。已有研究表明SATB1在人β珠蛋白基因簇上有多个结合位点,并转录调节胚胎期珠蛋白基因的表达以及通过促进结合位点间的靠近来调控β珠蛋白基因簇的整体空间结构。在本研究中,我们利用人γ珠蛋白基因启动子的AT富含区作为探针,捕获到核基质结合蛋白SATB2的结合。这段序列曾被发现具有结合SATB1的能力,但这种结合未在体内证实。进一步对SATB2的表达进行研究发现其在K562细胞和人脐血造血干细胞红系分化期间持续表达,并主要在小鼠发育早期阶段表达。通过体内和体外的结合实验,我们证实SATB2可以特异地结合在Gγ和Aγ珠蛋白基因的启动子上游区域且前者结合力较强。通过将Gγ和Aγ珠蛋白基因启动子区构建到报告基因的载体中进行实验,我们发现SATB2可以反式增强Gγ和Aγ启动子的活性。我们在K562细胞中分别过表达和干扰了SATB2蛋白,发现SATB2对γ珠蛋白基因起激活的作用。我们还检测了组蛋白修饰和RNA聚合酶Ⅱ的募集,发现染色质结构的变化与基因表达变化是一致的。我们进一步在人脐血来源的造血祖细胞中过表达和干扰了SATB2蛋白并诱导其向红系分化,证实了SATB2对γ珠蛋白基因的激活作用。我们进一步研究SATB2激活γ珠蛋白基因的分子机制。我们发现组蛋白乙酰化酶PCAF可以与SATB2相互作用并促进其反式激活能力,并被SATB2募集到γ珠蛋白基因启动子上。通过SATB2的串联亲和纯化实验我们发现SATB2与SATB1通过各自的PDZ蛋白区域相互作用,提示二者可能协同促进β珠蛋白基因簇的活性空间构象的组织。染色质构象捕获技术(chromosome conformation capture,3C)发现,SATB2可以促进Gγ和Aγ基因启动子区域的空间靠近,但并不影响其它元件所在染色质区域的空间靠近,说明SATB1和SATB2两个蛋白在β珠蛋白基因簇的调控中具有分工。ChIP-3C的实验证明这种空间靠近是SATB2蛋白介导的。进一步的蛋白质免疫共沉淀实验证明SATB2蛋白具有分子间自身相互作用,这种自我相互作用可能就是SATB2介导染色质靠近的原因。综上所述,我们的研究说明在红系细胞中,SATB2通过结合在Gγ和Aγ珠蛋白基因启动子区的AT富含区上,募集组蛋白乙酰化酶,促进丫珠蛋白基因的表达和染色质的活化,并促进Gγ和Aγ珠蛋白基因启动子区的空间靠近。本研究进一步丰富了SATB1介导的MAR元件空间靠近的结构,同时也为深入了解β珠蛋白基因簇活性染色质中心的结构提供了实验依据。

全文目录


目录  3-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-12
前言  12-31
  一、组蛋白修饰和高级染色质空间结构是真核基因表达调控的重要方式  12-17
    1 染色质水平的调控是真核基因表达调控的重要方式  12-13
    2 组蛋白修饰和高级染色质空间结构是染色质水平调控的重要方式  13-17
  二、核基质结合蛋白结合MAR元件并参与基因转录、染色质修饰和高级染色质结构  17-21
    1 MAR元件参与基因转录、染色质修饰和高级染色质结构  17-18
    2 SATB1在胸腺细胞调控基因转录并组织染色质空间结构  18-20
    3 SATB2在前B细胞和成骨细胞调控基因转录  20-21
  三、真核基因表达调控经典模型β珠蛋白基因簇的染色质结构受到核基质结合蛋白的调节  21-28
    1 β珠蛋白基因簇由上游LCR元件和下游具有发育阶段特异表达的珠蛋白基因组成  21-26
    2 β珠蛋白基因簇开放时超敏位点和下游基因发生空间靠近形成活性染色质中心  26
    3 核基质结合蛋白SATB1调节ε珠蛋白基因的表达并调控整个基因簇的空间结构  26-28
  四、本研究的理论依据与实验设计  28-31
材料与方法  31-60
  一、实验材料  31-34
    1 菌株与质粒  31
    2 细胞系及实验用小鼠  31
    3 限制性内切酶及修饰酶  31
    4 抗体  31-32
    5 引物合成  32
    6 其它主要试剂和材料  32-33
    7 主要仪器设备  33-34
  二、实验方法  34-60
    1 本研究的基本技术路线  34
    2 细菌操作与质粒的转化  34-36
      2.1 感受态大肠杆菌DH5α制备  34-35
      2.2 质粒的转化  35
      2.3 质粒的提取和纯化  35-36
    3. 实验中所用细胞的培养和处理  36-41
      3.1 细胞培养  36
      3.2 细胞传代  36-37
      3.3 细胞复苏及冻存  37
      3.4 K562细胞向红系诱导和检测  37-38
        3.4.1 K562细胞向红系分化诱导  37
        3.4.2 K562细胞红系分化的检测  37-38
      3.5 造血干细胞分离纯化和诱导培养  38-39
        3.5.1 单个核细胞分离和纯化  38
        3.5.2 CD34+造血祖细胞分离与诱导培养  38
        3.5.3 流式检测细胞表面抗原标记物  38-39
        3.5.4 Wright-Giemsa染色  39
      3.6 细胞转染  39
      3.7 逆转录病毒介导的细胞感染  39-41
        3.7.1 pMSCV逆转录病毒载体构建  39-40
        3.7.2 RNAi逆转录病毒载体构建  40
        3.7.3 逆转录病毒包装  40
        3.7.4 逆转录病毒感染靶细胞  40-41
        3.7.5 逆转录病毒感染后细胞筛选和混合克隆获得  41
    4 小鼠胚胎组织分离  41-42
    5 定量和半定量RT-PCR  42-43
      5.1 细胞总RNA的提取  42
      5.2 cDNA第一链合成  42
      5.3 RT-PCR检测  42-43
    6 Western-Blotting  43-46
      6.1 细胞总蛋白提取  43
      6.2 蛋白质浓度测定  43-44
      6.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  44
        6.3.1 聚丙烯酰胺凝胶制备  44
        6.3.2 样品制备、上样与电泳  44
      6.4 转膜  44-45
      6.5 抗原抗体反应  45
      6.6 辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白  45
      6.7 Western-Blotting中所用到的溶液  45-46
    7 双荧光素酶报告系统检测  46-47
      7.1 细胞转染  46-47
      7.2 荧光测定  47
    8 免疫荧光  47-48
      8.1 多聚甲醛固定  47
      8.2 增加细胞膜通透性  47
      8.3 封闭  47-48
      8.4 一抗孵育  48
      8.5 二抗孵育  48
      8.6 Hoechst染核  48
      8.7 封片  48
      8.8 激光共聚焦显微镜观察记录  48
    9 蛋白质免疫共沉淀和串联亲和纯化  48-50
      9.1 细胞裂解  48-49
      9.2 免疫共沉淀  49
      9.3 SDS-PAGE  49
      9.4 串联亲和纯化  49-50
    10 凝胶电泳阻滞实验(EMSA)分析  50-52
      10.1 抽提核蛋白  50
      10.2 生物素标记探针  50-51
      10.3 PAGE电泳转膜  51
      10.4 杂交及显影  51-52
      10.5 溶液配制  52
    11 生物素标记DNA沉淀实验  52-53
      11.1 抽提核蛋白(见EMSA)  52
      11.2 链亲和素琼脂糖珠预处理  52
      11.3 生物素标记DNA沉淀步骤  52-53
      11.4 缓冲液配制  53
    12 染色质免疫沉淀(ChIP)  53-56
      12.1 细胞固定  53
      12.2 细胞核提取  53
      12.3 细胞核裂解与超声处理  53-54
      12.4 超声结果分析  54
      12.5 免疫沉淀  54
      12.6 DNA分离及纯化  54-55
      12.7 PCR反应  55
      12.8 ChIP实验中所用的各种溶液  55-56
    13 染色质构象捕获技术(3C)  56-59
      13.1 交联固定的细胞核制备  56
      13.2 细胞裂解与细胞核分离  56
      13.3 台盼蓝染色检测细胞裂解情况  56-57
      13.4 非特异结合蛋白洗脱与SDS中和  57
      13.5 细胞核保存  57
      13.6 细胞核内染色质DNA的限制性内切酶消化与鉴定  57
        13.6.1 细胞核限制性内切酶消化  57
        13.6.2 限制性内切酶消化效率鉴定  57
      13.7 交联固定的染色质复合物内DNA分子的连接  57-58
        13.7.1 细胞核裂解与SDS中和  57-58
        13.7.2 染色质复合物内DNA分子的连接  58
      13.8 连接产物DNA的制备与定量  58-59
        13.8.1 染色质复合物解交联  58
        13.8.2 DNA片段纯化、回收与定量  58
        13.8.3 连接产物DNA线性扩增范围确定  58-59
    14 染色质免疫共沉淀与3C方法联合(ChIP-3C)  59-60
实验结果  60-91
  一、红系细胞中表达的核基质结合蛋白SATB2具有γ珠蛋白启动子MAR元件的结合能力  60-64
    1 生物素标记DNA探针沉淀法检测到SATB2具有结合在γ珠蛋白启动子MAR元件的能力  60-61
    2 SATB2在人胚胎胎儿期红系分化过程中持续表达并主要在小鼠发育早期表达  61-64
  二、SATB2特异结合到~Gγ和~Aγ珠蛋白基因启动子MAR元件上  64-72
    1 K562细胞中SATB2特异结合到~Gγ和~Aγ珠蛋白基因启动子上  64-68
      1.1 ChIp实验检测到SATB2在人γ珠蛋白基因启动子上结合  64-66
      1.2 测序和酶切法检测到SATB2在~Gγ启动子上的结合强于~Aγ启动子  66-68
    2 EMSA实验中SATB2可以特异结合到~GY和~Aγ珠蛋白基因启动子的MAR元件上  68-72
      2.1 EMSA实验中SATB2可结合在野生型人γ珠蛋白基因启动子上  68-70
      2.2 EMSA实验中SATB2无法结合突变AT富含区的人γ珠蛋白基因启动子  70-72
  三、SATB2在K562细胞和人原代红系分化细胞中激活人γ珠蛋白基因表达  72-82
    1 SATB2对人γ珠蛋白基因启动子具有反式激活能力  72-74
    2 K562细胞中SATB2上调人γ珠蛋白基因表达  74-80
      2.1 SATB2在K562细胞中上调人γ珠蛋白基因表达  74-76
      2.2 测序和酶切法检测到K562细胞中~Gγ的表达高于~Aγ珠蛋白  76-78
      2.3 SATB2促进人γ珠蛋白基因启动子组蛋白修饰和聚合酶Ⅱ募集  78-80
    3 SATB2在人原代红系分化细胞中上调人γ珠蛋白基因表达  80-82
  四、PCAF增强SATB2对人γ珠蛋白基因的激活作用  82-88
    1 K562细胞中SATB2和PCAF相互作用  82-83
    2 PCAF促进SATB2的反式激活能力  83
    3 SATB2增加了PCAF在人γ珠蛋白基因启动子上的募集  83-84
    4 串联亲和纯化法发现SATB2的相互作用蛋白SATB1等  84-88
  五、SATB2促进人~Gγ与~Aγ珠蛋白基因间的空间靠近  88-91
    1 SATB2介导人γ珠蛋白基因启动子间的空间靠近  88-89
    2 SATB2具有分子间自我相互作用  89-91
讨论  91-99
  一、核基质结合蛋白SATB1和SATB2参与基因转录调控  91-92
  二、SATB2在红系细胞中表达并调控γ珠蛋白基因表达  92-93
    1 SATB2在红系细胞中表达  92
    2 SATB2直接激活γ珠蛋白基因表达  92-93
    3 SATB2可募集辅因子PCAF参与其反式激活作用  93
  三、SATB2介导珠蛋白基因簇内~Gγ和~Aγ珠蛋白基因的空间靠近  93-94
    1 珠蛋白基因簇活化时具有活性染色质中心结构  93-94
    2 SATB2介导活性染色质中心内MAR元件的靠近  94
    3 SATB2介导MAR元件的靠近可能是基因表达上调的重要因素  94
  四、SATB1和SATB2对染色质高级结构组织中的协同分工  94-96
    1 SATB1和SATB2在Xist RNA的沉默功能和在ES细胞分化过程中的作用  94-95
    2 SATB1和SATB2在珠蛋白基因调控中具有协同与分工  95
    3 SATB1和SATB2可能形成同源/异源多聚物参与基因表达调控和染色质空间结构组织  95-96
  五、“活性~(G/A)γ-MAR靠近”模型  96-98
  六、本研究的不足与展望  98-99
小结  99-100
参考文献  100-106
文献综述  106-112
  参考文献  110-112
英文名词及缩写  112-113
致谢  113-114
个人简历  114-115

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