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花生四烯酸和二十碳五烯酸合成途径的构建及大豆种子特异性启动子的改造

作　者: 黎明
导　师: 李明春
学　校: 南开大学
专　业: 微生物学
关键词: 花生四烯酸 二十碳五烯酸 Δ8(ω6-Δ8，ω3-Δ8)途径 种子特异性启动子 转基因大豆 无选择标记 启动子改造
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


多不饱脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs),尤其是超长链多不饱和脂肪酸(Very long chain polyunsaturated fatty acids, VLC-PUFAs)，具有十分重要的生理功能，是维持人体健康所必需的。通常情况下PUFAs主要来源于深海鱼油和海洋藻类，但是由于过度捕捞，海洋污染以及藻类生产PUFAs价格的昂贵，因此迫切需要寻找一种PUFAs的替代来源。随着转基因技术的迅速发展，利用转基因的油料作物生产PUFAs被认为是一种十分有前景的的替代来源。大豆是最主要的油料作物之一，含有非常丰富的亚油酸(Linoleic acid, LA)和α-亚麻酸(α-Linolenic acid,ALA)，它们分别占大豆中总脂肪酸的55%和13%，是合成花生四烯酸(Arachidonic acid, ARA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)的前体。因此，大豆是通过代谢工程生产ARA和EPA的重要宿主。在转基因植物中，ARA和EPA生物合成的Δ6途径已经被广泛研究了，但Δ8途径仅在拟南芥中进行研究并且不是种子特异性表达。由于在转基因植物中ARA和EPA生物合成的Δ6途径存在复杂的底物转换瓶颈，因此，在本研究中，我们分别在酿酒酵母和大豆中重构ARA和EPA生物合成的Δ8途径，构建出产ARA和EPA的酿酒酵母工程菌和无选择标记基因的转基因大豆；同时对BCSP952启动子进行改造，以便提高转基因大豆中ARA和EPA的合成效率。首先，分别从球等鞭金藻H29(Isochrysis galbana H29)、小眼虫藻FH277(Euglena gracilis FH277)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)中克隆出Δ8途径中的三个基因Δ9延长酶基因IgASE2、Δ8脱氢酶基因efd2和Δ5脱氢酶基因ptd5，并在酿酒酵母INVSc1中鉴定它们的功能。IgASE2基因长1653bp，包括一个786bp的ORF (Open reading frame)、一个44bp的5’-UTR(Untranslatedregion)和一个823bp3’-UTR。该基因编码的延长酶IgASE2与已经报道的延长酶IgASE1的氨基酸序列有87%的相似性。IgASE2在酿酒酵母中表达时，能分别将LA和ALA转化成二十碳二烯酸(ω6-eicosadienoic acid, EDA)和二十碳三烯酸(ω3-eicosatrienoic acid, EtrA)，LA和ALA的转化率分别是57.6%和56.1%，表明IgASE2基因是一个新的C18-Δ9专一性的PUFAs延长酶基因。efd2基因ORF长1266bp，编码421个氨基酸，它与已经报道的EFD1的氨基酸序列相似性为96%。efd2基因在酿酒酵母中表达时，催化底物EDA和EtrA转化成二高γ-亚麻酸(dihomo-γ-linolenic acid, DGLA)和二十碳四烯酸(eicosatetraenoic acid, ETA)的转化效率分别约为31.2％和46.3％，表明efd2是一个位置专一性的Δ8脱氢酶基因。ptd5基因ORF长1410bp，编码469个氨基酸。它在酿酒酵母中表达时，催化DGLA和ETA生成ARA和EPA的效率分别约28.7%和37.2%，表明ptd5是一个位置专一性的Δ5脱氢酶基因。然后，利用克隆的IgASE2、efd2和ptd5基因，分别在酿酒酵母和大豆中构建了ARA和EPA生物合成的Δ8(ω6-Δ8, ω3-Δ8)途径，获得了产ARA和EPA的酿酒酵母工程菌和无选择标记基因的转基因大豆。根据ARA和EPA生物合成的Δ8(ω6-Δ8, ω3-Δ8)途径，将该途径中所需要的三个目的基因IgASE2、efd2和ptd5的表达盒有机集合在一起，构建成酿酒酵母共表达载体pYAE5。将该表达载体pYAE5转化至酿酒酵母INVSc1，构建成酿酒酵母工程菌YAE985。该菌在添加外源底物LA和ALA的诱导培养基中诱导表达后，产生的ARA和EPA分别占总脂肪酸含量的1.6%和2.5%，LA转化成ARA以及ALA转化成EPA的最终转化率分别是10.1%和16.9%。这些结果表明，在酿酒酵母中成功地构建了ARA和EPA生物合成的Δ8(ω6-Δ8, ω3-Δ8)途径。利用RT-PCR(Real Time PCR)对工程菌YAE985的遗传稳定性进行了检测，结果表明：工程菌连续转接20次后，IgASE2、efd2和ptd5基因在转录水平仍然保持1：1：1的关系，说明没有发生遗传重组和目的基因部分丢失的情况，因此酿酒酵母工程菌YAE985具有很好的遗传稳定性。用大豆种子特异性启动子BCSP952分别构建基因IgASE2、efd2和ptd5的表达盒，并克隆进表达载体pBX，构建成通过Δ8(ω6-Δ8, ω3-Δ8)途径生物合成ARA和EPA的无选择标记转基因大豆的表达载体pX9AE5。用根瘤农杆菌介导的方法进行大豆转化，筛选出含有Δ8(ω6-Δ8, ω3-Δ8)生物合成途径的转基因大豆。然后对阳性转化植株进行雌二醇诱导，进一步筛选出无选择标记的转基因大豆。转基因大豆种子中ARA和EPA的含量分别占总脂肪酸含量的6.8%和3.6%。这些结果表明，在无选择标记的转基因大豆中成功地构建了ARA和EPA生物合成的Δ8(ω6-Δ8, ω3-Δ8)途径。最后，为了提高转基因大豆中ARA和EPA的合成水平，本文对BCSP952进行了功能分析。在此基础上，对BCSP952进行改造，以提高BCSP952的强度。为了分析BCSP952的功能，分别构建了BCSP952的5-端缺失启动子片段BCSP666、BCSP471、BCSP285和BCSP156。将它们连接到pBI121质粒的GUS基因上游后转化拟南芥并通过GUS组化检测和GUS酶活性测定来鉴定这些启动子的功能。结果表明：BCSP666的活性与BCSP952活性基本相同，达到BCSP952活性的96.5%；BCSP471的活性次之，约为BCSP952活性的69.4%；BCSP285和BCSP156的活性相对较低，仅为BCSP952活性的15.5%和10.1%；除BCSP156片段外，其余5’-端缺失启动子片段都具有种子特异性。说明：种子特异性元件的种类和数量直接影响启动子的强度；并且，在BCSP952启动子的转录起始位点至上游约-594位这个区段内，种子特异性启动子元件的数量越多，启动子的活性越强，但是超过这个区域，增加这些元件的数量，并不能有效增加启动子的强度。为了提高BCSP952的强度，通过在BCSP952启动子的-140位插入ABRE和Sph元件，构建成启动子BCSP952-aa、 BCSP952-as和BCSP952-ss，并将它们转化至拟南芥中进行功能鉴定。GUS组化检测和GUS活性测定表明：GUS基因只在种子中表达，说明改造后的启动子是种子特异性的启动子；BCSP952-as控制的GUS活性最高，约为BCSP952的180%、BCSP952-aa控制的GUS活性次之，约为BCSP952的112%、BCSP952-ss控制的GUS活性反而降低，约为BCSP952的88%。然后，从每种类型的启动子中选择GUS活性最高的4个株系进行southern杂交和RT-PCR分析。Southern杂交表明，含有BCSP952-ss的一个株系的GUS基因是双拷贝，其余启动子的株系中GUS基因都是单拷贝。RT-PCR分析表明：BCSP952-as控制的GUS基因转录水平最高，BCSP952-aa次之，BCSP952-ss最低，这与测定的GUS活性是一致的。这些结果说明：通过对BCSP952进行改造，提高了BCSP952的强度；并且BCSP952的-140位插入一个ABRE和一个Sph元件时的BCSP952-as最强，其强度比BCSP952提高了80%，在BCSP952的-140位插入两个ABRE元件时的BCSP952-aa次之，其强度比BCSP952提高了12%，在BCSP952的-140位插入两个Sph元件时的BCSP952-ss的强度反而降低。

全文目录


中文摘要  5-8
Abstract  8-12
目录  12-20
符号说明  20-22
第一章 绪论  22-65
  第一节 多不饱和脂肪酸概述  22-28
    1.1.1 多不饱和脂肪酸的命名和主要类型  22-23
    1.1.2 PUFAs 的来源  23-25
    1.1.3 PUFAs 的生理功能  25-26
    1.1.4 PUFAs 的合成途径  26-28
      1.1.4.1 植物中 PUFAs 的生物合成  26
      1.1.4.2 动物中 PUFAs 的生物合成  26-28
      1.1.4.3 微生物中 PUFAs 的生物合成  28
  第二节 脂肪酸脱氢酶和脂肪酸延长酶的研究进展  28-40
    1.2.1 脂肪酸脱氢酶的研究进展  28-35
      1.2.1.1 脂肪酸脱氢酶的分类和基本特征  28-29
      1.2.1.2 植物中的 PUFAs 脱氢酶  29-30
      1.2.1.3 动物中的 PUFAs 脱氢酶  30-33
      1.2.1.4 低等真核生物中的 PUFAs 脱氢酶  33-35
    1.2.2 脂肪酸延长酶的研究进展  35-40
      1.2.2.1 脂肪酸延长酶系统的组成及延长过程  36-37
      1.2.2.2 哺乳动物体内的延长酶  37
      1.2.2.3 植物体内的延长酶  37-38
      1.2.2.4 微生物体内的延长酶  38-40
  第三节 PUFAs 代谢工程的研究进展  40-46
    1.3.1 用微生物生产 PUFAs 的代谢工程  40-42
    1.3.2 用植物生产 PUFAs 的代谢工程  42-45
      1.3.2.1 转基因植物生产 GLA 和 SDA  42-43
      1.3.2.2 转基因植物生产 VLC-PUFAs  43-45
    1.3.3 用转基因油料作物生产 PUFAs 的前景  45-46
  第四节 开发无选择标记的转基因植物的研究进展  46-52
    1.4.1 转基因植物概况  46
    1.4.2 开发无选择标记的转基因作物的意义  46-48
    1.4.3 开发无选择标记的转基因作物的策略  48-52
      1.4.3.1 共转化  48
      1.4.3.2 转座子介导方法  48-50
      1.4.3.3 位点特异性重组  50-52
  第五节 种子特异性启动子的研究进展  52-60
    1.5.1 已经克隆的种子特异性启动子  52-54
    1.5.2 种子特异性启动子序列结构特点  54-57
    1.5.3 与种子特异性启动子有关的反式作用因子  57-58
    1.5.4 种子特异性启动子功能的研究方法  58-60
      1.5.4.1 研究方法  58-59
      1.5.4.2 种子特异性启动子功能研究的报告基因  59
      1.5.4.3 种子特异性启动子功能研究的受体植物  59-60
    1.5.5 种子特异性启动子的应用展望  60
  第六节 选题依据和技术路线  60-65
    1.6.1 选题依据  60-62
    1.6.2 工作背景  62-63
    1.6.3 主要研究内容  63
    1.6.4 技术路线  63-65
第二章 Δ9 延长酶、Δ8 脱氢酶和Δ5 脱氢酶基因的克隆、序列分析及功能鉴定  65-116
  第一节 实验材料  65-68
    2.1.1 菌株  65
    2.1.2 质粒  65-66
    2.1.3 引物  66-67
    2.1.4 主要试剂  67
    2.1.5 主要仪器  67-68
  第二节 实验方法  68-87
    2.2.1 培养基配制  68-69
    2.2.2 试剂的配制  69-70
    2.2.3 藻类基因组 DNA 的提取 (CTAB 法)  70-71
    2.2.4 总 RNA 的提取  71
    2.2.5 DNA 和 RNA 的定量分析  71
    2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  71-72
    2.2.7 大肠杆菌的转化  72
    2.2.8 质粒 DNA 的提取  72-73
    2.2.9 酿酒酵母感受态细胞的制备及转化  73-75
    2.2.10 Δ9 延长酶基因 IgASE2 的克隆  75-80
      2.2.10.1 球等鞭金藻 H29 的培养  75
      2.2.10.2 球等鞭金藻 H29 总 RNA 的提取及反转录反应  75
      2.2.10.3 IgASE2 基因核心区的扩增与纯化  75-76
      2.2.10.4 重组质粒 pT-ASEC 的构建  76
      2.2.10.5 大肠杆菌的转化与筛选  76
      2.2.10.6 IgASE2 基因 5’区序列的克隆  76-78
      2.2.10.7 IgASE2 基因 3’区序列的克隆  78-79
      2.2.10.8 全长 IgASE2 基因的扩增及序列分析  79-80
    2.2.11 IgASE2 基因的功能分析  80-83
      2.2.11.1 表达载体 pYASE 的构建  80-81
      2.2.11.2 酿酒酵母工程菌的构建与筛选  81
      2.2.11.3 酿酒酵母工程菌的诱导表达  81-82
      2.2.11.4 酿酒酵母工程菌总脂肪酸的提取与甲酯化  82
      2.2.11.5 总脂肪酸的检测与分析  82-83
    2.2.12 Δ8 脱氢酶基因 efd 2 克隆  83-84
      2.2.12.1 小眼虫藻培养  83
      2.2.12.2 小眼虫藻总 RNA 的提取及反转录反应  83
      2.2.12.3 efd2 基因 ORF 的扩增与纯化  83-84
      2.2.12.4 重组质粒 pT-EFD 的构建与鉴定  84
      2.2.12.5 efd2 基因 ORF 的序列分析  84
    2.2.13 efd2 基因的功能分析  84-86
      2.2.13.1 表达载体 pYEFD 的构建  84-85
      2.2.13.2 酿酒酵母工程菌的构建与筛选  85
      2.2.13.3 酿酒酵母工程菌的诱导表达  85
      2.2.13.4 酿酒酵母工程菌总脂肪酸的提取与甲酯化  85-86
      2.2.13.5 总脂肪酸的检测与分析  86
    2.2.14 Δ5 脱氢酶基因 ptd5 克隆与功能鉴定  86-87
      2.2.14.1 三角褐指藻培养  86
      2.2.14.2 ptd5 基因的克隆与表达载体 pYPTD5 的构建  86-87
      2.2.14.3 酿酒酵母工程菌的构建、筛选与诱导表达  87
      2.2.14.4 酿酒酵母工程菌总脂肪酸的提取与甲酯化  87
      2.2.14.5 总脂肪酸的检测与分析  87
  第三节 结果与分析  87-109
    2.3.1 IgASE2 基因的克隆与序列分析  87-99
      2.3.1.1 IgASE2 基因的克隆策略  87-88
      2.3.1.2 球等鞭金藻总 RNA 的提取  88
      2.3.1.3 IgASE2 基因核心区序列的克隆  88-89
      2.3.1.4 IgASE2 基因 5’区序列的克隆  89-90
      2.3.1.5 IgASE2 基因 3’区序列的克隆  90-93
      2.3.1.6 全长 IgASE2 基因的克隆  93-94
      2.3.1.7 IgASE2 基因的序列分析  94-97
      2.3.1.8 IgASE2 基因的系统进化分析  97-99
    2.3.2 IgASE2 基因的功能分析  99-102
      2.3.2.1 IgASE2 基因酿酒酵母表达载体 pYASE 的构建  99
      2.3.2.2 酿酒酵母工程菌 YASE9 的构建与诱导表达  99-100
      2.3.2.3 通过 GC 和 GC-MS 鉴定 IgASE2 的功能  100-102
    2.3.3 efd2 基因的克隆与功能分析  102-106
      2.3.3.1 小眼虫藻 H277 总 RNA 的提取  102-103
      2.3.3.2 efd2 基因 ORF 的克隆  103
      2.3.3.3 efd2 基因的序列分析  103
      2.3.3.4 efd2 基因表达载体 pYEFD 的构建与鉴定  103-105
      2.3.3.5 efd2 基因的诱导表达与功能分析  105-106
    2.3.4 三角褐指藻 ptd5 基因的克隆与功能鉴定  106-109
      2.3.4.1 三角褐指藻 RNA 的提取  106
      2.3.4.2 ptd5 基因 ORF 的克隆与序列分析  106-107
      2.3.4.3 表达载体 pYPTD5 的构建与鉴定  107-108
      2.3.4.4 ptd5 基因的诱导表达与功能验证  108-109
  第四节 讨论  109-114
    2.4.1 IgASE2 基因的克隆与序列分析  109-112
    2.4.2 IgASE2 基因的功能分析  112
    2.4.3 efd2 基因的克隆与功能分析  112-113
    2.4.4 ptd5 基因的克隆与功能鉴定  113-114
  第五节 小结  114-116
第三章 ARA 和 EPA Δ８合成途径的构建  116-151
  第一节 实验材料  116-119
    3.1.1 菌株和大豆种子  116
    3.1.2 质粒  116-117
    3.1.3 引物  117-118
    3.1.4 主要试剂  118-119
    3.1.5 主要仪器  119
  第二节 实验方法  119-128
    3.2.1 培养基配制  119-120
    3.2.2 试剂的配制  120-121
    3.2.3 质粒 DNA 提取  121
    3.2.4 大豆基因组 DNA 提取 (异丙醇法)  121
    3.2.5 PCR 反应体系  121-122
    3.2.6 酶切体系  122-123
    3.2.7 酶切片段去磷酸化  123
    3.2.8 DNA 连接体系  123
    3.2.9 大肠杆菌的转化和筛选  123
    3.2.10 酿酒酵母的转化和筛选  123
    3.2.11 脂肪酸的提取与分析  123-124
    3.2.12 Real-time PCR 方法  124-126
    3.2.13 根瘤农杆菌的转化  126
      3.2.13.1 农杆菌感受态细胞的制备  126
      3.2.13.2 农杆菌的转化与鉴定  126
    3.2.14 大豆的转化  126-127
      3.2.14.1 重组农杆菌的活化  126-127
      3.2.14.2 大豆子叶节的获得  127
      3.2.14.3 大豆子叶节的转化及再生培养  127
    3.2.15 β-雌二醇诱导方法  127
    3.2.16 转基因植株的 PCR 检测  127-128
  第三节 结果与分析  128-142
    3.3.1 在酿酒酵母中构建 ARA 和 EPA 合成的Δ8 途径  128-134
      3.3.1.1 酿酒酵母共表达载体 pYAE5 的构建策略  128-129
      3.3.1.2 酿酒酵母表达载体 pYAE 的构建  129
      3.3.1.3 酿酒酵母表达载体 pYAE5 的构建  129-130
      3.3.1.4 酿酒酵母工程菌株 YAE985 的诱导表达与 PUFAs 分析  130-133
      3.3.1.5 酿酒酵母工程菌 YAE985 的遗传稳定性分析  133-134
    3.3.2 在大豆中中构建 ARA 和 EPA 合成的Δ8 途径  134-142
      3.3.2.1 表达载体 pXB 的构建  134-135
      3.3.2.2 无选择标记的共表达载体 pX9AE5 的构建  135-138
      3.3.2.3 转基因大豆的组织培养  138-139
      3.3.2.4 转基因大豆的筛选和鉴定  139-140
      3.3.2.5 转基因大豆选标记转基因的删除和鉴定  140-141
      3.3.2.6 无筛选标记转基因大豆的脂肪酸分析  141-142
  第四节 讨论  142-149
    3.4.1 产 ARA 和 EPA 酿酒酵母工程菌的构建与 PUFAs 分析  142-144
    3.4.2 无筛选标记的共表达载体 pX9AE5 的构建  144-146
    3.4.3 无筛选标记转基因大豆的遗传转化与筛选  146-148
    3.4.4 无筛选标记转基因大豆的 PUFAs 分析  148-149
  第五节 小结  149-151
第四章 大豆种子特异性启动子 BCSP952 的改造  151-177
  第一节 实验材料  151-154
    4.1.1 菌株和拟南芥种子  151
    4.1.2 质粒  151-152
    4.1.3 引物  152-153
    4.1.4 主要试剂  153
    4.1.5 主要仪器  153-154
  第二节 实验方法  154-159
    4.2.1 培养基配制  154
    4.2.2 试剂的配制  154-155
    4.2.3 质粒 DNA 提取  155
    4.2.4 拟南芥基因组 DNA 提取  155-156
    4.2.5 PCR 反应  156
    4.2.6 重叠 PCR  156
    4.2.7 酶切反应  156
    4.2.8 DNA 连接反应  156
    4.2.9 大肠杆菌的转化和筛选  156
    4.2.10 根瘤农杆菌的转化  156
    4.2.11 拟南芥的转化：花蕾转化法  156-157
      4.2.11.1 重组农杆菌的活化  156-157
      4.2.11.2 拟南芥的培养  157
      4.2.11.3 拟南芥的转化及转化子筛选  157
    4.2.12 转基因拟南芥的 GUS 酶活性分析  157-158
      4.2.12.1 组织化学检测 (Histochemical analysis)  157-158
      4.2.12.2 荧光光度检测 (Fluorometric analysis)  158
    4.2.13 Southern 杂交  158-159
    4.2.14 Real-Time PCR  159
  第三节 结果与分析  159-170
    4.3.1 启动子 BCSP952 的缺失分析  159-164
      4.3.1.1 BCSP952 启动子 5’端缺失的植物表达载体的构建  160-161
      4.3.1.2 农杆菌的转化与鉴定  161-162
      4.3.1.3 拟南芥的转化与筛选鉴定  162
      4.3.1.4 转基因拟南芥的 GUS 活性检测  162-164
    4.3.2 启动子 BCSP952 的改造  164-170
      4.3.2.1 BCSP952 启动子的改造及其植物表达载体的构建  164-165
      4.3.2.2 农杆菌的转化与鉴定  165-167
      4.3.2.3 拟南芥的转化与筛选鉴定  167
      4.3.2.4 转基因拟南芥的 GUS 活性检测  167-169
      4.3.2.5 转基因拟南芥的 Southern 杂交分析  169-170
      4.3.2.6 转基因拟南芥中 GUS 的表达分析  170
  第四节 讨论  170-175
    4.4.1 启动子 BCSP952 缺失突变分析  170-172
    4.4.2 启动子 BCSP952 的改造  172-175
  第五节 小结  175-177
    4.5.1 BCSP952 缺失突变分析  175
    4.5.2 BCSP952 的改造  175-177
第五章 结论与展望  177-180
  5.1 结论  177-178
  5.2 主要创新点  178
  5.3 相关工作的前景展望  178-180
参考文献  180-198
致谢  198-200
个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果  200-202

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  2. 高山被孢霉产生花生四烯酸的研究,TQ921
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  4. 产EPA土壤真菌的高通量筛选及发酵调控研究,TQ929
  5. 多选择标记植物表达载体的构建,Q943.2
  6. 降钙素基因相关肽在寻常型银屑病患者中的表达及其意义研究,R758.63
  7. 花生四烯酸的高效生物合成及定向转化研究,TQ463
  8. ω-3多不饱和脂肪酸诱导人肝癌细胞HepG2凋亡及其分子机制的研究,R735.7
  9. 三角褐指藻AA和EPA合成的Δ5脂肪酸去饱和酶研究,Q946
  10. 甘油酯型鱼油的制备及活性研究,TS254.53
  11. 转基因大豆、玉米、油菜品系鉴定方法,TS207.3
  12. 抗草甘膦转基因大豆对生物多样性影响,S565.1
  13. 抗草甘膦转基因大豆生物测定方法的研究,S565.1
  14. 二十碳五烯酸协同卡铂对人肺癌A-549细胞作用的研究,R734.2
  15. EPA、DHA对脂多糖刺激大鼠系膜细胞保护作用的机制研究,R692.3
  16. ω-3多不饱和脂肪酸对小鼠攻击行为的影响研究,R151
  17. 转基因大豆发酵制品在发酵过程中内、外源基因变化规律的研究,S565.1
  18. 用无载体无选择标记反义Cm-ACO1基因转化甜瓜品种河套蜜瓜的研究,S652
  19. 日粮添加ω-3PUFA对绍鸭产蛋性能、脂质代谢及免疫功能的影响,S834
  20. 大肠杆菌DH10B甘露糖-6-磷酸异构酶表达与功能鉴定及转cry3A基因马铃薯抗性表达分析,Q943.2
  21. 富含多不饱和脂肪酸甘油酯的酶法制备,TS225.24

中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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