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短波长光质诱导津田芜菁花青素合成相关基因差异表达机制研究

作　者: 王宇
导　师: 李玉花
学　校: 东北林业大学
专　业: 发育生物学
关键词: 短波长光质芜菁花青素 CHS家族基因转录组差异表达
分类号: Q943
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

短波长光质例如蓝光与紫外线是调节植物生长发育重要的环境因子之一。蓝光会影响植物的生长形态如：向光性、叶绿体移动、气孔张开和花青素积累。高强度的紫外线会破坏植物体内的DNA, RNA和蛋白质,而低强度的紫外线会影响植物的生长形态变化、类黄酮类的合成和防御相关基因的表达。然而紫外线调控花青素的信号传递途径至今并未被阐明。本论文以花青素合成光敏感型的津田芜菁(Brassica rapa’Tsuda’)为试材,进行了短波长光质诱导花青素合成特性的研究；CHS家族基因的克隆及短波长光质诱导下的表达特性分析；花青素合成相关R2R3类MYB因子的克隆及其他调节基因在短波长光质诱导下的表达特性分析；花青素合成关键调节因子BrPAP1和BrTT8与BrCHS1启动子区Unit1元件的相互作用分析；不同短波长光质诱导下转录组学分析。得到以下主要结果：1津田芜菁在不同短波长光质诱导下花青素积累特性分析对蓝光、UV-A和UV-B及它们之间的复合光对津田芜菁幼苗下胚轴不同部位花青素的积累进行了分析。不同短波长光质诱导下花青素积累部位并不相同：(1)蓝光诱导花青素合成主要集中在下胚轴的上部；(2)UV-B诱导在上部和中部；(3)UV-A诱导在中下部。同时,蓝光+UV-B复合光的照射会产生增益效应,而其他光质的组合并没有这种现象。UV-A及蓝光+UV-B复合光可以诱导成熟津田芜菁膨大的肉质根表皮花青素积累。2CHS家族基因的克隆及短波长光质诱导下的表达特性分析利用Southern杂交确认津田芜菁基因组中至少存在六个CHS基因拷贝,利用RT-PCR扩增获得BrCHS5和BrCHS6基因的全长克隆。加上本实验室前期工作中克隆获得的BrCHS1-4基因,在获得的六个CHS基因中,BrCHS1,4,5受光诱导表达,而其余三个没有光反应。BrCHSl,4,5特异地受UV-A及蓝光+UV-B复合光诱导在津田芜菁幼苗下胚轴的中下部表达,这与色素积累的部位保持一致。其中BrCHS5的表达量随光照时间延长及光照强度增加而线性积累,而BrCHS4受蓝光+UV-B诱导表达量最高。相反的,BrCHS基因在蓝光诱导下仅在下胚轴上部微弱表达。同时CHS与DFR基因在成熟津田芜菁中的光诱导表达特性与花青素积累特性类似。3花青素合成相关R2R3类MYB因子的克隆及其他调节基因在短波长光质诱导下的表达特性分析利用PCR克隆获得6个可能参与花青素合成R2R3类MYB基因,实时荧光定量PCR结果表明：无论在津田芜菁幼苗还是成熟的肉质根表皮PAP1基因的表达均受光调控,且表达特性与花青素积累特性类似。同时MYB4, MYB12和MYB111基因在不同短波长光质诱导下在幼苗下胚轴不同部位表达模式具有特异性。BrTT8也受光诱导,表达量相对较低,表明其可能作为一个辅助因子参与花青素的合成。4花青素合成关键调节因子BrPAP1和BrTT8与BrCHS1启动子区Unit1元件的相互作用分析通过PCR克隆获得BrCHS4和BrCHS5基因启动子序列,加上本实验室前期工作中克隆获得的BrCHS1基因启动子,利用生物信息学的方法分析得到BrCHSl,4,5启动子区由ACE, RRE和MRE光反应元件组成的顺式作用元件CHS-Unit1。通过酵母单杂交实验证明,津田芜菁BrPAP1、BrTT8和BrHY5因子可以与BrCHS1启动子区CHS-Unit1元件发生特异性的相互作用。5不同短波长光质诱导下的转录组学分析利用RNA-seq技术分析了不同短波长光质处理6小时的津田芜菁转录组的变化。共获得50703个平均长度为1286.44bp的Unigene,其中有847个受UV-A特异诱导的基因,包含花青素合成相关基因CHS、F3H和DFR等,并含有MYB、bHLH和zinc finger等转录因子和其他信号转导因子,分别参与胁迫反应、含硫氨基酸合成代谢反应、应答化学物刺激和色素的合成等过程。利用MEME软件对UV-A特异诱导基因群的启动子区进行保守元件预测分析,获得了一个可能与UV-A反应相关的顺式作用元件,但其功能还需要相关试验进一步的验证。以上结果表明,津田芜菁花青素合成存在三种不同的光诱导反应：UV-A反应、蓝光+UV-B增益效应和蓝光/UV-A反应。UV-A诱导的花青素合成是不同于隐花色素或UV-B受体介导的花青素合成的新途径。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-16
1 绪论  16-31
  1.1 引言  16
  1.2 光受体及光信号转导研究进展  16-22
    1.2.1 光敏色素受体及其介导的红光、远红光信号转导  17-18
    1.2.2 隐花色素受体及其介导的蓝光/UV-A信号转导  18-19
    1.2.3 趋光素受体及其介导的蓝光信号转导  19-20
    1.2.4 Zeitlupe类受体及其介导的蓝光信号转导  20-21
    1.2.5 UV-B受体及其介导的UV-B光信号转导  21-22
  1.3 植物花青素合成及调控的研究进展  22-26
    1.3.1 植物花青素合成途径相关结构基因  23-24
    1.3.2 植物花青素合成途径相关调节基因  24-26
  1.4 基于下一代高通量测序技术的转录组学分析  26-29
    1.4.1 传统转录组学研究进展  27
    1.4.2 下一代高通量测序技术研究进展  27-29
    1.4.3 转录组学测序技术(RNA-Seq)研究进展  29
  1.5 研究的目的及意义  29-31
第二章不同短波长光质诱导津田芜菁花青素合成特性分析  31-37
  2.1 引言  31
  2.2 材料与方法  31-33
    2.2.1 试验材料  31
    2.2.2 试验光源  31
    2.2.3 试验试剂及仪器  31-32
    2.2.4 试验方法  32-33
  2.3 结果与分析  33-35
    2.3.1 不同短波长光质诱导津田芜菁幼苗的花青素合成特性分析  33-34
    2.3.2 短波长光照诱导津田芜菁膨大的肉质根表皮花青素合成分析  34-35
  2.4 讨论  35-36
  2.5 本章小结  36-37
第三章不同短波长光质诱导津田芜菁CHS家族基因表达特性分析  37-59
  3.1 引言  37
  3.2 材料与方法  37-47
    3.2.1 试验材料  37
    3.2.2 试验光源  37
    3.2.3 试验试剂及仪器  37-38
    3.2.4 试验方法  38-47
  3.3 结果与分析  47-57
    3.3.1 津田芜菁BrCHS家族基因Southern杂交分析  47
    3.3.2 津田芜菁BrCHS5和BrCHS6基因全长克隆及序列分析  47-51
    3.3.3 津田芜菁BrCHS家族基因生物信息学分析  51-53
    3.3.4 不同短波长光质诱导津田芜菁幼苗下胚轴不同部位BrCHS家族基因表达特性分析  53-54
    3.3.5 不同时长的不同短波长光质诱导津田芜菁幼苗下胚轴不同部位BrCHS5和BrDFR基因表达特性分析  54-55
    3.3.6 不同强度UV-A诱导津田芜菁幼苗下胚轴不同部位BrCHS5基因表达特性分析  55-56
    3.3.7 不同短波长光质诱导成熟津田肉质根表皮BrCHS和BrDFR基因表达特性分析  56-57
  3.4 讨论  57-58
  3.5 本章小结  58-59
第四章不同短波长光质诱导津田芜菁花青素合成相关调节基因表达特性分析  59-77
  4.1 引言  59-60
  4.2 材料与方法  60-61
    4.2.1 试验材料  60
    4.2.2 试验光源  60
    4.2.3 试验试剂及仪器  60
    4.2.4 试验方法  60-61
  4.3 结果与分析  61-75
    4.3.1 津田芜菁R2R3类MYB基因的全长克隆  61-71
    4.3.2 津田芜菁R2R3类MYB基因序列生物信息学分析  71-73
    4.3.3 不同短波长光质诱导津田芜菁幼苗下胚轴不同部位色素合成相关调节基因表达特性分析  73-75
    4.3.4 不同短波长光质诱导成熟津田芜菁肉质根表皮色素合成相关调节基因表达特性分析  75
  4.4 讨论  75-76
  4.5 本章小结  76-77
第五章津田芜菁BrPAP1和BrTT8蛋白与BrCHS启动子区Unit1元件相互作用分析  77-85
  5.1 引言  77
  5.2 材料与方法  77-80
    5.2.1 试验材料  77-78
    5.2.2 试验试剂及仪器  78
    5.2.3 试验方法  78-80
  5.3 结果与分析  80-83
    5.3.1 津田芜菁BrCHS4、BrCHS5基因启动子区的克隆  80-81
    5.3.2 津田芜菁BrCHS1,4,5基因启动子区生物信息学分析  81-83
    5.3.3 酵母单杂交验证津田芜菁BrPAP1和BrTT8蛋白与BrCHS启动子区Unit1元件相互作用分析  83
  5.4 讨论  83-84
  5.5 本章小结  84-85
第六章基于RNA-Seq技术的津田芜菁不同光环境下转录组学分析  85-105
  6.1 引言  85
  6.2 材料与方法  85-91
    6.2.1 试验材料  85
    6.2.2 试验光源  85
    6.2.3 试验试剂及仪器  85-86
    6.2.4 试验方法  86-91
  6.3 结果与分析  91-102
    6.3.1 总RNA质检分析  91-92
    6.3.2 文库构建及质检分析  92-93
    6.3.3 测序及质控分析  93-94
    6.3.4 测序结果统计分析  94-95
    6.3.5 测序数据预处理  95
    6.3.6 基于de Bruijn graphs法的De novo组装及下游分析  95-102
  6.4 讨论  102-104
  6.5 本章小结  104-105
结论  105-106
论文创新点  106-107
参考文献  107-124
附录  124-139
攻读学位期间发表的学术论文  139-140
致谢  140-141

短波长光质诱导津田芜菁花青素合成相关基因差异表达机制研究

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