学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

AtATM3和CYP2E1基因增强转基因紫花苜蓿抗重金属和有机物能力研究

作　者: 范兆乾
导　师: 王繁业
学　校: 青岛科技大学
专　业: 药物化学
关键词: 紫花苜蓿 AtATM3基因 CYP2E1基因 复合污染
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 1次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


近年来,随着工业化进程的加快,我国的环境污染形势日益严峻,土壤污染问题凸显,严重阻碍经济发展和损害人体健康,因此控制与修复土壤污染势在必行。目前,土壤污染修复主要包括物理/化学修复和生物修复两大类。植物修复技术因更加快速、高效、费用低,且便于推广,近年来呈现出良好的发展前景。本研究旨在利用转基因技术将两个基因转入紫花苜蓿以提高其对土壤重金属和有机物复合污染的修复能力；AtATM3和细胞色素氧化酶基因CYP2E1是两种分别与重金属和有机物抗性、积累相关的基因。目前,国内外尚未出现同时利用这两个基因进行土壤修复的报道。实验构建含有CYP2E1基因的植物表达载体：用目的基因替换表达载体pBI121上的Gus基因,构建P35S-CYP2E1-T35S表达盒,即质粒pBI121-CYP2E1。然后通过冻融法将表达载体pBI121-CYP2E1,同另一植物表达载体pCambia-AtATM3转入同一农杆菌LBA4404中。实验选取“阿尔冈金”紫花苜蓿下胚轴作为基因转化受体,通过组织培养研究,筛选并优化胚性愈伤组织的诱导分化条件,构建并优化了适合“阿尔冈金”的遗传转化再生体系。经共转化将AtATM3基因和CYP2E1基因导入“阿尔冈金”紫花苜蓿中。经共培养、选择培养最终获得了186株抗卡那霉素的转基因植株。筛选出的186株抗性植株应用PCR和RT-PCR进行分子学水平检测后,对转基因植株的抗重金属和有机物功能进行了鉴定。结果表明所获得抗性紫花苜蓿植株整合了外源目的基因AtATM3和CYP2E1并有效表达。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-6
主要符号说明  6-14
第一章 综述  14-31
  1.1 土壤污染  14-16
    1.1.1 土壤重金属污染现状及危害  14-15
    1.1.2 有机物污染现状及危害  15-16
  1.2 土壤修复方法  16-24
    1.2.1 物理修复法  16-17
    1.2.2 化学修复法  17
    1.2.3 生物修复法  17-18
      1.2.3.1 微生物修复  18
      1.2.3.2 植物修复  18
    1.2.4 植物修复研究进展  18-24
      1.2.4.1 植物修复重金属污染  18-20
      1.2.4.2 植物修复有机物污染  20-21
      1.2.4.3 转基因植物修复重金属污染和有机物污染的研究进展  21-23
      1.2.4.4 植物修复发展前景  23-24
  1.3 转基因紫花苜蓿研究进展  24-28
    1.3.1 构建转基因苜蓿的常用方法  24-26
      1.3.1.1 聚乙二醇(PEG)介导的转化  24-25
      1.3.1.2 电激法  25
      1.3.1.3 基因枪转化  25
      1.3.1.4 显微注射法  25
      1.3.1.5 超声波介导的转化  25
      1.3.1.6 农杆菌介导的转化  25-26
      1.3.1.7 超声波辅助农杆菌介导的转化  26
    1.3.2 苜蓿遗传转化研究进展  26-28
      1.3.2.1 品种改良  26-27
      1.3.2.2 转抗寒及抗旱基因苜蓿  27
      1.3.2.3 转抗病虫害基因苜蓿  27
      1.3.2.4 转耐盐性基因苜蓿  27
      1.3.2.5 转抗除草剂基因苜蓿  27-28
      1.3.2.6 转修复土壤污染基因苜蓿  28
  1.4 研究目的及意义  28-31
    1.4.1 阿尔冈金紫花苜蓿简介  28-29
    1.4.2 目的基因AtATM3和CYP2E1简介  29-30
    1.4.3 本课题的目的和意义  30-31
第二章 含有AtATM3和CYP2E1双质粒农杆菌的转化  31-54
  2.1 实验材料  31-34
    2.1.1 菌种及质粒  31
    2.1.2 仪器及设备  31-32
    2.1.3 主要试剂及溶液的配制  32-34
      2.1.3.1 主要试剂  32-33
      2.1.3.2 主要溶液的配制  33-34
    2.1.4 主要培养基成分和配制方法  34
    2.1.5 酶及引物  34
  2.2 实验方法  34-44
    2.2.1 CYP2E1基因植物表达载体的构建  34-41
      2.2.1.1 载体质粒的保存  35-38
        2.2.1.1.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备  35
        2.2.1.1.2 质粒转化大肠杆菌  35
        2.2.1.1.3 质粒DNA的小量提取(碱裂解法)  35-36
        2.2.1.1.4 筛选阳性克隆  36-38
          2.2.1.1.4.1 引物设计与PCR验证  36-37
          2.2.1.1.4.2 琼脂糖凝胶电泳  37-38
        2.2.1.1.5 冰箱冷冻保存  38
      2.2.1.2 克隆载体pMD18-T-CYP2E1的构建、转化及筛选  38-40
        2.2.1.2.1 目的片段的PCR扩增  38-39
          2.2.1.2.1.1 质粒的小量提取  38
          2.2.1.2.1.2 目的片段的PCR扩增  38
          2.2.1.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳  38
          2.2.1.2.1.4 PCR产物胶回收(利用胶回收试剂盒)  38-39
        2.2.1.2.2 PCR回收片段与pMD18-T载体的连接  39
        2.2.1.2.3 连接产物转化大肠杆菌感受态  39
          2.2.1.2.3.1 大肠杆菌感受态制备  39
          2.2.1.2.3.2 重组质粒的转化  39
        2.2.1.2.4 重组载体的鉴定  39-40
          2.2.1.2.4.1 蓝白斑筛选阳性克隆  39
          2.2.1.2.4.2 小量提取阳性克隆质粒  39
          2.2.1.2.4.3 阳性克隆的PCR鉴定  39
          2.2.1.2.4.4 阳性克隆的双酶切鉴定  39-40
          2.2.1.2.4.5 阳性克隆测序  40
      2.2.1.3 植物双元表达载体pBI121-CYP2E1的构建  40-41
        2.2.1.3.1 表达质粒pBI121 DNA片段的获得  40
          2.2.1.3.1.1 质粒pBI121的双酶切  40
          2.2.1.3.1.2 目的片段胶回收  40
        2.2.1.3.2 CYP2E1基因片段的获得  40-41
          2.2.1.3.2.1 克隆载体pMD18-T-CYP2E1的双酶切  40-41
          2.2.1.3.2.2 目的片段胶回收  41
        2.2.1.3.3 表达载体pBI121-CYP2E1的构建  41
          2.2.1.3.3.1 目的片段的连接  41
          2.2.1.3.3.2 重组质粒转化大肠杆菌DH5α  41
        2.2.1.3.4 重组质粒pBI121-CYP2E1的提取鉴定  41
    2.2.2 含有pCambia1302-AtATM3和pBI121-CYP2E1双质粒农杆菌的转化  41-44
      2.2.2.1 含有pCambia1302-AtATM3和pBI121-CYP2E1单质粒农杆菌的转化  41-42
        2.2.2.1.1 农杆菌LBA4404感受态的制备  41-42
        2.2.2.1.2 冻融法将pCambia1302-AtATM3和pBI121-CYP2E1分别转化入农杆菌LBA4404感受态  42
        2.2.2.1.3 农杆菌转化子的鉴定与保存  42
          2.2.2.1.3.1 农杆菌转化子质粒DNA的提取  42
          2.2.2.1.3.2 PCR鉴定  42
          2.2.2.1.3.3 农杆菌转化子的保存  42
      2.2.2.2 含有pCambia1302-AtATM3和pBI121-CYP2E1双质粒农杆菌的转化  42-44
        2.2.2.2.1 含pBI121-CYP2E1质粒农杆菌LBA4404感受态的制备  42-43
        2.2.2.2.2 冻融法将pCambia1302-AtATM3转化入含pBI121-CYP2E1的感受态农杆菌LBA4404  43
        2.2.2.2.3 农杆菌转化子的鉴定与保存  43
        2.2.2.2.4 转化子的生长周期  43
        2.2.2.2.5 培养时间对双质粒共存的影响  43-44
          2.2.2.2.5.1 生长时间对双质粒保存的影响  43
          2.2.2.2.5.2 继代次数对双质粒保存的影响  43-44
  2.3 实验结果  44-50
    2.3.1 CYP2E1基因植物表达载体的构建  44-46
      2.3.1.1 质粒DNA的提取  44
      2.3.1.2 PCR扩增  44
      2.3.1.3 PCR产物与T载体连接,蓝白斑筛选重组子  44-45
      2.3.1.4 重组质pMD18-T-CYP2E1的鉴定  45
      2.3.1.5 质粒DNA测序鉴定  45
      2.3.1.6 植物双元表达载体pBI121-CYP2E1的构建及鉴定  45-46
    2.3.2 含有AtATM3和CYP2E1双质粒农杆菌的转化  46-50
      2.3.2.1 含质粒农杆菌的PCR鉴定  46-47
      2.3.2.2 含pCambia302-AtATM3质粒农杆菌的PCR鉴定  47
      2.3.2.3 含pCambia302-AtATM3和pBI121-CYP2E1双质粒农杆菌的PCR鉴定..  47-49
      2.3.2.4 含pCambia1302-AtATM3和pBI121-CYP2E1双质粒的农杆菌的生长周期  49-50
      2.3.2.5 培养时间对pCambia1302-AtATM3和pBI121-CYP2E1双质粒共存的影响  50
  4 分析与讨论  50-54
第三章 紫花苜蓿再生体系的构建与优化  54-65
  3.1 实验材料  54-57
    3.1.1 外植体材料  54
    3.1.2 仪器及设备  54
    3.1.3 主要试剂及溶液的配制  54-57
      3.1.3.1 试剂  54-55
      3.1.3.2 主要溶液的配制  55-57
  3.2 实验方法  57-59
    3.2.1 无菌苗的获得  57
    3.2.2 愈伤组织的培养  57-58
      3.2.2.1 苗龄对愈伤出愈的影响实验  57
      3.2.2.2 外植体对Kan的耐受力试验  57
      3.2.2.3 外植体对Amp的敏感性试验  57
      3.2.2.4 不同激素对愈伤组织分化的影响  57-58
      3.2.2.5 不同植物生长调节剂配比对分化率的影响及分化情况  58
    3.2.3 农杆菌浸染外植体  58
    3.2.4 共培养  58
    3.2.5 紫花苜蓿愈伤组织的脱菌筛选培养  58
    3.2.6 愈伤组织的继代培养  58
    3.2.7 愈伤组织分化增殖  58
    3.2.8 无根苗的生根诱导  58-59
  3.3 实验结果  59-64
    3.3.1 无菌苗的培养  59
    3.3.2 单因素实验结果  59-63
      3.3.2.1 苗龄对芽再生的影响  59
      3.3.2.2 Kan浓度对愈伤组织的影响  59-61
      3.3.2.3 Amp浓度对愈伤组织的影响  61-62
      3.3.2.4 不同激素浓度对诱导胚性愈伤组织的影响  62
      3.3.2.5 不同生长调剂剂浓度对诱导胚性愈伤组织的影响  62-63
    3.3.4 无菌苗的获得  63-64
  3.4 分析与讨论  64-65
第四章 转基因植株的分子检测及功能鉴定  65-80
  4.1 实验材料  65-66
    4.1.1 仪器及设备  65
    4.1.2 主要试剂及溶液的配制  65-66
    4.1.3 引物(上海博尚生物合成)  66
  4.2 实验方法  66-69
    4.2.1 转基因植株的分子检测  66-69
      4.2.1.1 转基因植株的PCR检测  66-68
        4.2.1.1.1 转基因紫花苜蓿基因组DNA提取  66-67
        4.2.1.1.2 PCR检测  67-68
      4.2.1.2 转基因植株的RT-PCR检测  68-69
        4.2.1.2.1 转基因紫花苜蓿总RNA的提取  68
        4.2.1.2.2 RT-PCR检测  68-69
    4.2.2 植物的生长与耐受实验  69
      4.2.2.1 野生型苜蓿幼苗对重金属和有机物的耐受实验  69
      4.2.2.2 转基因植株对重金属和有机物的耐受实验  69
  4.3 实验结果  69-78
    4.3.1 转基因紫花苜蓿基因组DNA的提取  69-70
    4.3.2 PCR检测转基因紫花苜蓿  70-72
    4.3.3 转基因紫花苜蓿总RNA的提取  72
    4.3.4 转基因紫花苜蓿的RT-PCR检测  72-74
    4.3.5 幼苗对重金属和有机物的耐受实验  74-75
      4.3.5.1 幼苗对重金属的耐受实验  74
      4.3.5.2 幼苗对有机物的耐受实验  74-75
    4.3.6 成熟植株对重金属和有机物的耐受实验  75-78
      4.3.6.1 成熟植株对重金属的耐受实验  75-76
      4.3.6.2 成熟植株对有机物的耐受实验  76-77
      4.3.6.3 成熟植株对重金属和有机物复合污染的耐受实验  77-78
  4.4 分析与讨论  78-80
全文结论  80-82
参考文献  82-88
致谢  88-89
攻读学位期间发表的学术论文目录  89-90

相似论文

  1. 氮肥对紫花苜蓿根系形态发育的影响,S541.9
  2. 紫花苜蓿根系生长与地上部生长的相关性分析,S541.9
  3. 西藏地区紫花苜蓿和多年生黑麦草干草调制与贮藏技术的研究,S816.53
  4. 高温胁迫条件下紫花苜蓿抑制消减cDNA文库的构建与初步分析,S541.9
  5. 血红素加氧酶-1参与水杨酸对镉诱导的紫花苜蓿根部氧化胁迫的调节作用,S541.9
  6. 多环芳烃污染土壤的植物—微生物联合修复效应,X53
  7. 光周期对不同秋眠类型紫花苜蓿phyA、phyB mRNA和植物激素含量的影响,S541.9
  8. 太原盆地紫花苜蓿水分利用效率研究,S541.9
  9. Cd-磺胺间甲氧嘧啶单一及复合污染的生态毒性效应研究,X171.5
  10. 渭北旱塬不同立地条件紫花苜蓿生长特征研究,S541.9
  11. 低温胁迫对紫花苜蓿根颈膜脂脂肪酸含量的影响,S541.9
  12. 十溴联苯醚和铜复合污染对土壤微生物的生态毒理效应,X172
  13. 土壤性质对重金属铅镉稳定化过程的影响研究,X131.3
  14. 提高紫花苜蓿（Medicago sativa L）杂交技术的研究,S541.9
  15. 菲、芘对蚯蚓（Eisenia foetida）的毒性机理研究,X174
  16. 苜蓿草粉饲粮添加纤维素酶对蛋鸡生产性能、蛋品质和养分消化率的影响,S831.5
  17. 梁滩河流域重金属复合污染研究,X522
  18. 阳离子表面活性剂和重油复合体系在海洋沉积物上的吸附行为,X55
  19. 镉—苯并[α]芘复合污染对菲律宾蛤仔毒性效应的研究,X174
  20. 空间搭载紫花苜蓿种子第一代植株表型变异及基因多态性分析,S541.9
  21. 陇东野生紫花苜蓿同工酶和SSR标记分析,S541.9

中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
© 2012 www.xueweilunwen.com