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百脉根小GTPase ROP6激活蛋白GAP的分离和鉴定

作　者: 李荣
导　师: 张忠明
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 百脉根 共生固氮 小G蛋白 小G蛋白激活蛋白 酵母双杂交
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


豆科植物和根瘤菌共生固氮作用在现代可持续发展农业中具有重要的意义。共生固氮研究的重点主要集中在豆科植物对根瘤菌结瘤因子的识别和信号传递、根瘤菌侵入线及根瘤形成的分子机制,以揭示豆科植物与根瘤菌共生固氮体系形成的奥秘。本研究在发现小GTPase ROP6参与调节百脉根共生信号转导的基础上,比对百脉根数据库,鉴定出三个与ROP6相关的激活蛋白GAP蛋白,利用酵母体内双杂交和pulldown技术证实它们能与ROP6的CA突变体相互作用。主要的研究结果如下：1.利用已经报道的拟南芥等物种的RopGAPs蛋白序列比对百脉根数据库,鉴定到几个RopGAP蛋白,通过PCR扩增获得其中三个基因。它们分别是LjRacGAP1, LjRacGAP2, LjRacGAP3。已有的研究表明,这三个基因编码的蛋白分别具有与另外两个百脉根小GTPase Rac1和Rac2组成活化突变体相互作用的功能,其中Rac2在根瘤发育的过程中表达有所增强。2.ROP6有两个突变体,组成型活化突变体ROP6-CA (constitutively active mutants)和功能缺失突变体ROP6-DN (dominant negative mutants),利用体外蛋白pull-down和酵母双杂交体内实验验证了三个GAP蛋白与ROP6突变体蛋白之间的相互作用,发现它们都能特异性与ROP6-CA互相作用,而不能与野生型和DN突变的ROP6相互作用。3.ROP6是一个小GTPase,体外GTPase酶活性检测表明,ROP6具有微弱的GTPase酶活性。在反应体系中加入纯化的LjRacGAP1蛋白,增强了ROP6的GTPase酶活性,说明GAP蛋白具有激活ROP6的功能。4.Real-Time RT-PCR研究结果表明,LjRacGAP1, LjRacGAP2, LjRacGAP3三个基因在接种和未接种的根中均有表达。其中LjRacGAP1的表达不受接种根瘤菌的影响；LjRacGAP2在接种根瘤菌2天表达下调,而后则趋于稳定；LjRacGAP3在接种根瘤菌2天和6天呈显著下调表达,尤其是6天时未接种的表达量是接种的10倍左右,说明这个基因可能参与根瘤发育的调控。5.利用毛根转化技术将LjRacGAP1导入百脉根中超量表达,接种根瘤菌后根瘤的表型表明超表达LjRacGAP1转基因植株上的结瘤数减少,成熟根瘤普遍没有对照组大,这结果表明该基因可能参与调控并延迟根瘤的发育。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-9
缩略语表  9-11
1 文献综述  11-30
  1.1 共生固氮的概念与意义  11
  1.2 根瘤形成与早期信号转导  11-16
    1.2.1 根瘤的形成  11-12
    1.2.2 共生早期信号转导  12-16
  1.3 植物中的ROP小G蛋白  16-23
    1.3.1 ROP小G蛋白  16-17
    1.3.2 ROP的调控机制  17-18
    1.3.3 ROP功能的多样性  18-23
  1.4 ROP蛋白的激活蛋白RopGAP  23-28
    1.4.1 RopGAP的分类  24
    1.4.2 RopGAP蛋白的结构和调控机制  24-26
    1.4.3 GAP的功能分析  26-28
    1.4.4 RopGAP的靶物蛋白  28
  1.5 研究目的及意义  28-30
2 材料与方法  30-49
  2.1 材料  30-33
    2.1.1 质粒和菌株  30-31
    2.1.2 植物材料  31
    2.1.3 分子生物学和植物转化相关试剂  31-32
    2.1.4 主要的培养基  32-33
  2.2 方法  33-49
    2.2.1 酵母双杂交验证蛋白相互作用  33-40
    2.2.2 体外蛋白Pull-down分析蛋白质之间的相互作用  40-44
    2.2.3 表达分析  44-46
    2.2.4 GTP酶活检测  46
    2.2.5 超表达载体的构建毛根转化  46-49
3 结果与分析  49-62
  3.1 蛋白序列分析与三维结构预测  49-52
    3.1.1 LjGAPs蛋白序列分析  49-52
    3.1.2 LjRacGAPs蛋白的三维结构预测  52
  3.2 Rop6与GAPs蛋白酵母体内相互作用  52-54
    3.2.1 载体的构建  52-53
    3.2.2 酵母体内验证相互作用  53-54
  3.3 体外western蛋白相互作用  54-57
  3.4 RacGAP对ROP6的酶激活作用  57-58
  3.5 GAPs时空表达分析  58-60
  3.6 GAPs生物学功能的初步研究  60-62
4 讨论、总结及展望  62-66
  4.1 总结  62
  4.2 讨论  62-64
  4.3 展望  64-66
参考文献  66-75
附录一：本研究所用引物  75-77
致谢  77

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学
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