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水稻组织特异表达启动子的克隆及功能分析

作　者: 颜彦
导　师: 林拥军
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻启动子组织特异表达 GUS基因缺失分析
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

利用基因工程技术可以有效改良农作物性状进而增加农作物产量。启动子作为一种重要的基因表达调控元件,被广泛的应用于植物基因工程中。其中组织器官特异型启动子可以调控外源基因在植物体内所需要的组织或器官表达,在增强转基因效果的同时可以减少异源蛋白对植物发育带来的副作用,但是目前来源于作物本身的组织器官特异型启动子仍处于一个较缺乏的状况,因此对这类启动子的克隆有着良好的应用价值。水稻作为重要的粮食作物,利用组织器官特异型启动子对其特定性状进行改良具有很大的经济效益。鉴于以上情况,本研究的目的即是从水稻基因组中分离克隆出新的组织器官特异型启动子,为培育转基因水稻提供有用的工具。本研究取得的结果主要有以下几点：1.以本实验室水稻全生育期基因表达谱芯片数据为基础,经过RT-PCR验证后挑选出3个绿色组织特异表达的基因、1个根特异表达的基因和1个胚乳特异表达的基因,利用PCR法分离克隆出这5个基因上游的启动子,分别命名为PYY2、PYY4、 PYY7、PYY6和DXCP35。2.将这5个启动子分别连接报告基因GUS后转化至水稻中,对转基因苗的各个组织进行GUS染色,验证启动子的表达谱。经验证后发现,PYY2、PYY4、PYY7均为绿色组织特异表达启动子；DXCP35为一个胚乳特异表达启动子；PYY6不符合预测的结果,在各个组织均不表达。3.对DXCP35进行5’端缺失分析,共构建了6个缺失载体,通过对缺失载体的转化苗进行验证后发现,DXCP35-308与DXCP35-112之间的区域直接决定着该启动子的活性。4.对PYY2进行5’端缺失分析,共构建了7个缺失载体,通过对缺失载体的转化苗进行验证后发现,592bp长度的启动子就能维持叶片和叶鞘特异表达模式,且活性最高。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-10
缩略词表  10-11
1 文献综述  11-27
  1.1 研究问题的由来  11-12
  1.2 真核生物启动子的结构和特征  12-15
    1.2.1 基本转录因子  12-13
    1.2.2 核心启动子  13-15
  1.3 启动子在植物基因工程中的研究及应用  15-23
    1.3.1 组成型启动子  15-16
    1.3.2 组织器官特异型启动子  16-20
    1.3.3 诱导型启动子  20-22
    1.3.4 向启动子  22
    1.3.5 人工合成启动子  22-23
  1.4 研究启动子常用的方法与技术  23-26
    1.4.1 全长启动子的分离克隆  23
    1.4.2 启动子的生物信息学分析  23
    1.4.3 启动子表达模式的验证  23-24
    1.4.4 启动子的缺失分析  24
    1.4.5 凝胶阻滞试验  24-25
    1.4.6 酵母单杂交技术  25-26
  1.5 目的与意义  26-27
2 材料与方法  27-38
  2.1 水稻品种  27
  2.2 载体及菌株  27
  2.3 实验试剂  27
  2.4 候选基因的基本信息  27-28
    2.4.1 DX35的基本信息  27-28
    2.4.2 YY2的基本信息  28
    2.4.3 YY4的基本信息  28
    2.4.4 YY7的基本信息  28
    2.4.5 YY6的基本信息  28
  2.5 明恢63基因组DNA及不同组织RNA的反转录  28-29
  2.6 候选基因表达模式的鉴定  29
    2.6.1 DX35表达模式的鉴定  29
    2.6.2 YY2表达模式的鉴定  29
    2.6.3 YY4、YY7和YY6表达模式的鉴定  29
  2.7 启动子的分离克隆及序列分析  29-31
    2.7.1 DXCP35的分离克隆及序列分析  29-30
    2.7.2 P_(YY2)的分离克隆及序列分析  30
    2.7.3 P_(YY4)、P_(YY7)和P_(YY6)的分离克隆及序列分析  30-31
  2.8 启动子的表达载体构建及其遗传转化  31-33
    2.8.1 DXCP35及其系列缺失的表达载体构建及其遗传转化  31
    2.8.2 P_(YY2)及其系列缺失的表达载体构建及其遗传转化  31-32
    2.8.3 启动子P_(YY4)、P_(YY7)和P_(YY6)的表达载体构建及其遗传转化  32-33
  2.9 T_0代转基因植株的PCR阳性检测  33
  2.10 阳性植株的组织化学染色  33-35
  2.11 P_(YY2)及其缺失片段转基因植株的GUS活性定量检测  35-38
    2.11.1 相关试剂准备  36
    2.11.2 总蛋白的提取  36-37
    2.11.3 总蛋白浓度测定  37
    2.11.4 GUS活性测定  37-38
3 结果与分析  38-48
  3.1 候选基因表达模式的鉴定  38
  3.2 启动子的分离克隆  38-39
    3.2.1 启动子DXCP35及其缺失片段的分离克隆  38-39
    3.2.2 启动子P_(YY2)及其缺失片段的分离克隆  39
    3.2.3 启动子P_(YY4)、P_(YY7)和P_(YY6)的分离克隆  39
  3.3 启动子的序列分析  39-42
  3.4 启动子组织化学染色结果  42-46
    3.4.1 DXCP35组织化学染色结果及相应缺失片段的表达模式  42-44
    3.4.2 P_(YY2)组织化学染色结果及相应缺失片段的表达模式  44
    3.4.3 P_(YY4)、P_(YY7)和P_(YY6)组织化学染色结果  44-46
  3.5 启动子P_(YY2)及其相应缺失片段GUS活性定量检测  46-48
4 讨论  48-51
  4.1 胚乳特异表达启动子DXCP35  48
  4.2 绿色组织特异表达启动子P_(YY2)  48-49
  4.3 绿色组织特异表达启动子P_(YY4)和P_(YY7)以及启动子P_(YY6)  49-50
  4.4 有关报告基因  50-51
参考文献  51-61
附录1 启动子DXCP35的核苷酸序列  61-62
附录2 启动子P_(YY2)的核苷酸序列  62-64
附录3 启动子P_(YY4)的核苷酸序列  64-66
附录4 启动子P_(YY7)的核苷酸序列  66-68
附录5 启动子P_(YY6)的核苷酸序列  68-70
附录6 植物表达载体示意图  70-71
致谢  71

水稻组织特异表达启动子的克隆及功能分析

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