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尖孢镰刀菌小RNA发生相关Dicer,Argonaute和Rdrp基因功能研究

作　者: 梁丽琴
导　师: 谢丙炎；李健强
学　校: 中国农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 尖孢镰刀菌小RNA发生 Dicer Argonaute Rdrp
分类号: Q933
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

在真核生物中,小RNA具有修饰染色质,降解mRNA,抑制mRNA翻译,抑制转座子转位、抵御病毒侵袭等重要的调控作用。小RNA的发生与作用机制是在一系列小RNA发生蛋白的参与下完成的。本文以粘团专化型尖孢镰刀菌生理小种1号(FOX-A8)为代表,通过基因敲除三类主要的小RNA发生相关基因家族Dicer(Dcr1和Dcr2)、Argonaute(Agol和Ago2)及RNA dependent RNA polymerase (Rdrp1、Rdrp2和Rdrp3),比较基因敲除突变体(ΔDcr、ΔAgo、ΔRdrp)与野生型之间的生长表型及致病力的差异,探讨Dcr、Ago及Rdrp的基因功能,为揭示尖孢镰刀菌小RNA发生的分子遗传机制奠定理论基础。具体研究结果如下：1.Dcr2基因与菌丝生长发育明显相关,与野生型的菌丝相比较,ΔDcr2及ΔDcr1/2菌丝分支较多,但是对分生孢子的形态并无影响；ΔDcr1、ΔDcr2及ΔDcr1/2总生物量基本没有差异,但是突变体的菌丝量减少,而分生孢子量却较多,说明Dcr基因在菌丝的营养生长及发育繁殖之间起重要的调控作用；对甘蓝的侵染结果表明,敲除Dcr基因之后对尖孢镰刀菌的致病力并无明显的影响；2.Ago1基因与分生孢子形态发育相关,与野生型的分生孢子相比较,ΔAgol的分生孢子变成了类似于酵母细胞的圆形球体,大小为野生型分生孢子的二分之一左右,且在液体中能以类似芽殖酵母的繁殖方式进行繁殖；Ago2基因与菌丝发育有关,ΔAgo2的菌丝变得较细且分支增多；Agol基因与Ago2基因均抑制尖孢镰刀菌在生长早期产生分生孢子,促进菌丝的延伸生长；Ago基因对尖孢镰刀菌的致病力并无太大影响；3. Rdrp2及Rdrp3基因与分生孢子的形态及繁殖方式相关,与野生的分生孢子相比较,ARdrp2和ARdrp3的分生孢子变为枸杞状,大小为野生型分生孢子的十分之一左右,且能够以类似芽殖酵母的繁殖方式进行繁殖,另外还可以以一种类似于孢子囊的大型产孢器产生一系列小的枸杞状分生孢子的方式繁殖；Rdrp2和Rdrp3基因与菌丝发育有关,ΔRdr1、ΔRdrp2及ΔRdrp3的菌丝形态均发生了畸形,其中ΔRdrp2及ΔRdrp3的菌丝比野生型的菌丝分支增多；培养温度为14℃C和33℃C时,ΔRdrp1、ΔRdrp2及ΔRdrp3的生长速度较野生型缓慢；ΔRdrp1、ΔRdrp2及ΔRdrp3的分生孢子产量较野生型逐次增多,菌丝产量较野生型逐次减少,但是总生物量并没有发生变化；ΔRdrp1、ΔRdrp2及ΔRdrp3对甘蓝的致病力减弱,其中ARdrp2及ARdrp3对甘蓝的致病力减弱较明显,说明Rdrp基因与尖孢镰刀菌的致病力具有一定关系。总之,Dcr、Ago和Rdrp基因均在不同程度上影响了尖孢镰刀菌的生长发育,值得关注的是ΔAgo1、ΔRdrp2及ΔRdrp3的分生孢子形态发生了明显的变化,具体变化机理目前还不清楚,且未有相关类似的报道,还有待于进一步研究。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-19
第一章引言  19-37
  1.1 国内外研究现状  19-35
    1.1.1 真菌中小RNA的发现  19-24
    1.1.2 小RNA发生相关蛋白  24-33
    1.1.3 真菌小RNA的生成及其作用机制  33-34
    1.1.4 尖孢镰刀菌的研究概况及目前存在的问题  34-35
  1.2 研究目的及意义  35
  1.3 研究内容与技术路线  35-37
    1.3.1 研究内容  35-36
    1.3.2 技术路线  36-37
第二章粘团专化型尖孢镰刀菌Dicer基因功能的研究  37-69
  2.1 前言  37-38
  2.2 方法  38-53
    2.2.1 寻找10种尖孢镰刀菌Dcr基因序列并进行生物信息学分析  38
    2.2.2 RT-PCR验证Dcr基因  38-43
    2.2.3 构建Dcr基因敲除盒  43-47
    2.2.4 原生质体制备  47-48
    2.2.5 原生质体转化  48-49
    2.2.6 PCR验证Dcr基因敲除突变体  49-50
    2.2.7 Southern杂交验证Dcr基因敲除突变体  50-52
    2.2.8 Dcr基因突变体与野生型菌株生长表型的比较  52-53
    2.2.9 Dcr基因突变体与野生型菌菌株对甘蓝致病力的比较  53
  2.3 结果  53-66
    2.3.1 11种尖孢镰刀菌Dcr基因的生物信息学分析结果  53-58
    2.3.2 提取总RNA检测  58
    2.3.3 RT-PCR检测Dcr基因结果  58
    2.3.4 Dcr基因敲除载体构建菌液PCR结果  58-59
    2.3.5 Dcr基因敲除盒酶切验证结果  59
    2.3.6 Dcr基因突变体与野生型菌株分生孢子、幼殖体及原生质体的制得  59-60
    2.3.7 潮霉素及新霉素抑菌浓度的确定  60
    2.3.8 原生质体的再生及转化子生长情况  60-61
    2.3.9 Dcr基因突变体的获得及PCR验证结果  61-62
    2.3.10 Dcr基因突变体Southern杂交结果  62
    2.3.11 Dcr基因突变体与野生型菌株的生长表型比较结果  62-66
    2.3.12 Dcr基因突变体与野生型菌株对甘蓝致病力的比较结果  66
  2.4 讨论  66-68
  2.5 结论  68-69
第三章粘团专化型尖孢镰刀菌Argonaute 基因功能的研究  69-85
  3.1 前言  69-70
  3.2 方法  70-72
    3.2.1 寻找10种尖孢镰刀菌的Ago基因序列并进行生物信息学分析  70
    3.2.2 RT-PCR验证Ago基因  70
    3.2.3 构建Ago基因敲除盒  70-71
    3.2.4 原生质体制备  71
    3.2.5 原生质转化  71
    3.2.6 PCR验证Ago基因敲除突变体  71
    3.2.7 Southen验证Ago基因敲除突变体  71-72
    3.2.8 Ago基因突变体与野生型菌株生长表型的比较  72
    3.2.9 Ago基因突变体与野生型菌菌株对甘蓝致病力的比较  72
  3.3 结果  72-84
    3.3.1 11种尖孢镰刀菌Ago基因的生物信息学分析结果  72-76
    3.3.2 RT-PCR检测Ago基因结果  76
    3.3.3 Ago基因敲除载体构建菌液PCR结果  76-77
    3.3.4 Ago基因突变体的获得及PCR验证结果  77
    3.3.5 Ago基因敲除突变体Southern杂交结果  77-78
    3.3.6 Ago基因突变体与野生型菌株的生长表型比较结果  78-83
    3.3.7 Ago基因突变体与野生型菌株对甘蓝致病力的比较结果  83-84
  3.4 讨论  84
  3.5 结论  84-85
第四章粘团专化型尖孢镰刀菌Rdrp基因功能的研究  85-100
  4.1 前言  85-86
  4.2 方法  86-88
    4.2.1 寻找10种尖孢镰刀菌的Rdrp基因序列并进行生物信息学分析  86
    4.2.2 RT-PCR验证Rdrp基因  86
    4.2.3 构建Rdrp基因敲除盒  86-87
    4.2.4 原生质体制备  87
    4.2.5 原生质转化  87
    4.2.6 PCR验证Rdrp基因敲除突变体  87
    4.2.7 Southen验证Rdrp基因敲除突变体  87
    4.2.8 Rdrp基因突变体与野生型菌株生长表型的比较  87-88
    4.2.9 Rdrp基因突变体与野生型菌菌株对甘蓝致病力的比较  88
  4.3 结果  88-99
    4.3.1 11种尖孢镰刀菌Rdrp基因的生物信息学分析结果  88-92
    4.3.2 RT-PCR检测Rdrp基因结果  92
    4.3.3 Rdrp基因敲除载体构建菌液PCR结果  92-93
    4.3.4 Rdrp基因突变体的获得及PCR验证结果  93-94
    4.3.5 Rdrp基因敲除突变体Southern杂交结果  94
    4.3.6 Rdrp基因突变体与野生型菌株的生长表型比较结果  94-98
    4.3.7 Rdrp基因突变体与野生型菌株对甘蓝致病力的比较结果  98-99
  4.4 讨论  99
  4.5 结论  99-100
第五章结论与展望  100-101
参考文献  101-112
致谢  112-113
个人简历  113-114
发表文章  114

尖孢镰刀菌小RNA发生相关Dicer,Argonaute和Rdrp基因功能研究

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