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JNK的激活通过c-Jun蛋白在转录水平上调节Mule的表达

作　者: 田雪君
导　师: 刘新垣；刘菁
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Mule Miz1 c-Jun JNK transcription regulation
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 29次
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内容摘要


本论文主要报道了不仅Mule可以调节TNFα诱导的JNK激活和细胞凋亡,JNK的激活同样对Mule有正反馈效应,通过转录因子c-Jun在转录水平上调节Mule基因的表达。背景: JNK信号通路对从细胞的增殖和分化到细胞的程序性死亡在内的广泛的细胞活动调节,都起到了非常关键的作用,同样的,在一些疾病的发生和发展中也扮演了非常重要的角色,这其中包括糖尿病和癌症。JNK在物理应力,细胞因子,T细胞共刺激和生长因子等各种胞外刺激的作用下做出应答,通过MAP激酶模式下一系列蛋白的顺序性磷酸化得到激活。JNK有两个普遍表达的同源异构体,JNK1和JNK2。有报道说明JNK1,而非JNK2,是实现TNFα诱导的JNK激活,c-Jun蛋白表达和细胞凋亡所必需的。作为一个重要的转录因子,Miz1通过激活或抑制转录参与调节了DNA损伤应答,细胞周期停滞,细胞增值,分化和凋亡的过程。除了转录因子的功能,Miz1还可以作为信号或通路特异性的调节子(SMOR)特异性地调节TNFα诱导地JNK1激活和细胞死亡。在TNFα的刺激下,含有HECT结构域的E3泛素连接酶Mule泛素化Miz1,释放Miz1对JNK1激活的阻遏作用,进而引起JNK信号通路的激活和细胞凋亡。目的:尽管Mule控制一些关键分子的水平,调节相关的信号转导的功能已经得到了共识,但是Mule仍是一个没有得到透彻理解的新的蛋白。它巨大的结构暗示Mule本身仍隐藏了许多的可能性。在高度动态的信号网络中,Mule又是怎样受到调节的机制仍不清楚。这篇论文尝试证明,不仅Mule可以调节TNFα诱导的JNK激活和细胞凋亡,JNK的激活对Mule也有反馈效应,调节Mule的表达。方法:首先,用免疫印迹法检测Mule, Miz1, JNK, p38,和c-Jun在野生型(WT), Jnk1-/- and Jnk2-/-细胞中蛋白的表达情况。我们把JNK1重新引进Jnk1-/-细胞,在HEK293细胞中过表达JNK1,或用siRNA降低JNK1的表达,用免疫印迹法分别检测Mule的表达水平。采用半定量RT-PCR检测Mule在WT, Jnk1-/- and Jnk2-/-细胞中mRNA的表达水平。我们用USCS得到了预测的Mule启动子序列,把它亚克隆到没有启动子的荧光素酶报告基因质粒pGL2-Basic中,命名为MP-LUC。在共转录RSV-c-Jun或者空载体,以及TNFα分别诱导WT, Jnk1-/- and Jnk2-/-的情况下,用荧光素酶活性分析法检测Mule启动子的活性。最后,我们用TFSEARCH程序(1.3版本)鉴别得到了Mule启动子上的AP-1结合位点。在不受TNFα刺激和在TNFα刺激的情况下,采用染色质免疫沉淀分析法(ChIP)分别检测体内c-Jun蛋白和Mule启动子上AP-1位点的结合情况。结果:免疫印迹法分析显示Mule的蛋白水平在Jnk1-/-细胞中大大减少,其c-Jun蛋白的表达量也少于Jnk2-/-和WT细胞。把JNK1重新引进Jnk1-/-细胞,Mule的蛋白表达得到了部分修复。通过转染HA-JNK1质粒在HEK293细胞中过表达JNK1,进一步增加了Mule蛋白的表达。通过siRNA基因沉没降低JNK1的表达,大大减少了Mule的表达水平。半定量RT-PCR检测显示,Mule的mRNA在WT,Jnk1-/-和Jnk2-/-细胞中的表达情况和其蛋白的表达情况一致。共转染RSV-c-Jun促进了Mule启动子的活性,而且其活性的增强趋势与c-Jun表达的增强趋势相一致。TNFα刺激下, Jnk2-/-细胞中MP-LUC的活性大大增强,其程度高于在WT细胞中。而MP-LUC的报告基因表达情况在TNFα后没有明显的改变。染色质免疫沉淀分析法显示,在未受刺激的情况下,WT细胞中c-Jun已经结合在Mule启动子上的AP-1位点,TNFα诱导JNK激活进一步促进c-Jun和Mule启动子上AP-1位点的结合。结论:转录因子c-Jun,是AP-1家族的主要一员,它是JNK激活的重要下游效应子。被JNK特异性磷酸化激活后,c-Jun和Mule启动子上的AP-1位点结合,进一步促进Mule的转录。在这里,JNK对Mule的调节起到了一个正反馈的作用,通过c-Jun蛋白在转录水平上调节Mule的表达。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
CHAPTER ONE INTRODUCTION  11-18
  1 THE JNK SIGNALING PATHWAY  11-13
  2 MYC-INTERACTING ZINC-FINGER PROTEIN 1 (MIZ1)  13-14
  3 MULE: AN E3 UBIQUITIN LIGASE  14-18
CHAPTER TWO MATERIALS AND METHODS  18-29
  1 REAGENTS AND ANTIBODY  18
  2 PLASMIDS AND SIRNA  18
  3 BACTERIA AND TRANSFORMATION  18
  4 CELL CULTURE  18-19
  5 PLASMIDS PREPARATION  19-21
    5.1 Mini-prep procedure  19
    5.2 Large-prep procedure  19-21
      5.2.1 Harvest cells  19
      5.2.2 Lyse cells  19-20
      5.2.3 Purify the plasmid DNA  20-21
  6 TRANSFECTION  21
    6.1 Exgene 500  21
    6.2 Lipofectamine 2000  21
  7 WESTERN BLOT  21-23
    7.1 SDS-PAGE Gel Preparation  21-22
    7.2 Preparation of cell extraction (6-well plate)  22
    7.3 Running gel  22
    7.4 Transferring  22-23
    7.5 Blotting  23
    7.6 Developing  23
  8 RT-PCR  23-24
    8.1 RNA preparation  23-24
    8.2 RT reaction  24
    8.3 PCR reaction  24
  9 LUCIFERASE REPORTER ASSAY  24-26
    9.1 Plasmids and construction  24-25
    9.2 Solution preparation  25-26
    9.3 Measure luciferase activity  26
  10 CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION (CHIP) ASSAY  26-28
    10.1 Preparation  26
    10.2 Sonication  26-27
    10.3 Immunoprecipitation  27
    10.4 PCR reaction  27-28
  11 STATISTICAL ANALYSIS  28-29
CHAPTER THREE RESULTS AND DISCUSSION  29-37
  1 EXPRESSION LEVELS OF MULE IN WT, JNK1-/- AND JNK2-/- MEFS  29-30
  2 REINTRODUCTION OF JNK1 TO JNK1-/- MEFS  30
  3 OVER EXPRESSION OF JNK1 IN HEK293 CELLS  30-31
  4 THE KNOCKDOWN OF JNK1 EXPRESSION BY SIRNA IN HEK293 CELLS  31-32
  5 MRNA LEVELS OF MULE IN WT, JNK1-/- AND JNK2-/- MEFS  32
  6 LUCIFERASE REPORTER ASSAY  32-35
    6.1 MP-LUC construction  32-33
    6.2 The Mule promoter activity in HEK293 cells transfected RSV-c-Jun or empty vector  33-34
    6.3 The Mule promoter activity with TNFαstimulation in WT, Jnk1-/- and Jnk2-/- MEFs  34-35
  7 CHIP ASSAY  35-37
    7.1 Visualization the efficiency of sonication  35-36
    7.2 Analysis of c-Jun binding at the Mule promoter by ChIP assay  36-37
CHAPTER FOUR CONCLUSION  37-39
APPENDIX  39-41
  1. EXPRESSION LEVELS OF OTHER PROTEINS IN WT, JNK1-/- AND JNK2-/- MEFS ANALYZED BY IMMUNOBLOTTING  39
  2. SEQUENCE OF MULE PROMOTER  39-41
ACKNOWLEDGEMENTS  41-42
REFERENCES  42-45

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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