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CD441ICD在弥漫大B淋巴瘤细胞株中作用的研究

作　者: 陈大燕
导　师: 冯茹
学　校: 南方医科大学
专　业: 内科学
关键词: 弥漫大B细胞淋巴瘤 CD44 CD44ICD Stat3 NF-κB
分类号: R733.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常见的一种类型,占成人淋巴瘤的30%～40%。DLBCL是一组异质性疾病,无论是细胞来源、临床表现、对化疗反应情况还是预后,不同个体之间存在较大差异。DLBCL(?)临床表现具有一定的侵袭性,尽管大多数DLBCL患者对传统的CHOP方案联合化疗敏感,但真正能治愈的患者不到一半。难治复发是DLBCL患者治疗面临的一项巨大挑战。美罗华的应用很大程度上提高了DLBCL患者的临床疗效。通过cDNA微阵列和寡核苷酸技术,可从分子生物学上将DLBCL分为生三种亚型：发中心B细胞样(germinal center B-cell-like, GCB)和活化B细胞样(activated-B-cell-like, ABC)及第三型。Hans等应用免疫组化检测了患者CD10、Mum-1、Bcl-6三种抗体的检测,将DLBCL主要分为GCB型(CD10+BCL-6+或CD10-BCL-6+MUM1-)和non-GCB型(CD10-BCL-6-或CD10-BCL-6+MUM1+)。GCB型和non-GCB型分别来源于正常生发中心B细胞或活化的外周血记忆B细胞,具有独特的基因表达谱。就预后而言,两种类型的DLBCL,预后明显不同。细胞粘附分子肿瘤的侵袭性生长和转移与细胞表面的粘附分子密切相关。CD44蛋白是较常见的一种细胞粘附蛋白,它广泛分布于细胞表面,像其他粘附分子一样,主要参与细胞与细胞、细胞与外界基质环境的粘附和信号传导等[3]。一般来说标准的CD44分子由细胞外结构域、跨膜区、胞内结构域(CD44intracellular domain, CD44ICD)组成。CD44胞外结构域包含透明质酸结合部位,通过结合细胞外基质主要成分透明质酸而达到细胞粘附的作用。CD44在相关蛋白酶的作用下可以发生一系列有序的水解,逐渐释放出细胞外结构和细胞内结构[4]。释放的CD44胞外结构域和CD44ICD作用不同。胞外结构释放后形成可溶性CD44片段(soluble CD44, sCD44)。sCD44释放后仍可与透明质酸结合,并且可以通过竞争性与透明质酸结合而起到干扰CD44与细胞外基质粘附的作用。CD44ICD在Y分泌酶作用下从细胞膜上释放,进入细胞核,并参与包括CD44在内的转录调节。多种细胞刺激因子和生长因子通过细胞表面受体可以激活STATs途径。Stat3(Signal transducer and activator of transcription 3,Stat3)是STATs家族中最易发生磷酸化的蛋白,它存在于细胞浆,与细胞酪氨酸磷酸化信号通道偶联。Stat3的表达增高或持续激活可以诱导细胞增殖、阻止细胞凋亡,增加细胞转化能力。通过抑伟(?)Stat3表达或降低激活状态的Stat3水平是肿瘤治疗的新方向。核转录因子NF-κB(nuclear transcription factorκB, NF-κB)是广泛存在于真核生物细胞内的一种可诱导的转录因子家族蛋白。大多数的细胞中,NF-κB与其抑制蛋白家族IkBs结合,定位于细胞浆中。当细胞浆中NF-κB发生磷酸化时,IkBs在蛋白酶作用下降解,NF-κB可从细胞浆转运至细胞核,在细胞核中与相应的DNA序列结合,上调靶基因表达,而反馈调节作用也可以使NF-κB重新处于抑制状态。肿瘤细胞中,NF-κB的双向调节作用被打破,而变为持续激活状态。这一作用可能使一部分基因表达受抑制,这些基因主要参与细胞周期信号、凋亡、细胞粘附和细胞迁移。由此可见NF-κB与肿瘤的发生、发展密切相关。研究目的DLBCL患者疾病进展及耐药的产生与肿瘤细胞的转录调控失调有很大关系,通过影响肿瘤细胞转录调控而达到肿瘤治疗的目的是治疗复发难治的DLBCL一种重要手段。本研究旨在通过应用分子生物学的方法了解DLBCL细胞中CD44ICD的表达,并明确其亚细胞定位,进而观察其对ABC-DLBCL细胞迁移,增殖的影响。并了解CD44ICD与转录调节重要通路NF-κB、Stat3的关系,以探讨其作用机制。以期为DLBCL治疗寻求新的治疗方向。方法1、细胞株：ABC-DLBCL细胞株SUDLH2、Ly3和GBC-DLBCL细胞株Ly8；2、流式细胞仪检测SUDLH2、Ly3、Ly8细胞株中CD44的表达情况；3、Western Bloting检测SUDLH2细胞株是否存在CD44ICD的表达,并明确其细胞内定位；4、Western Bloting检测SUDLH2细胞株不同浓度γ分泌酶抑制剂DAPT处理后细胞中CD44ICD变化,并检测抑制CD44ICD表达浓度的γ分泌酶抑制剂对SUDLH2、Ly3、Ly8细胞内Stat3、NF-κB含量的影响；5、MTT法检测不同浓度的DAPT细胞处理SUDLH2、Ly8后24、48、72小时OD值；6、Transwell方法检测0μM、10μM、100μM的DAPT处理后,计算两种细胞的迁移率；7、结果采用SPSS 13.0软件进行统计学分析；单因素均数比较使用One-Way ANOVA方差分析,多因素均数比较使用析因设计分析进行统计,若方差齐使用Bonferroni方法进行多重比较；若方差不齐则使用采用近似F检验(Welch方法)代替方差分析后采用Dunnett T3方法进行多重比较；计量资料用x±s表示,检验水准为a=0.05,双侧检验。结果1、CD44的表达水平流式细胞仪检测三种细胞株SUDLH2、Ly3、Ly8细胞表面CD44的表达,其表达水平分别为(74.57±5.03)%、(44.01±3.70)%、(0.14±0.03)%；2、CD44ICD的表达以及定位Western Bloting检测SUDLH2细胞中CD44ICD存在表达,1μM的DAPT不能明显抑制SUDLH2细胞CD44ICD表达,5μM的DAPT即可抑制CD44ICD表达。CD44ICD在SUDLH2细胞的细胞浆、细胞核中均有表达,但主要定位于细胞核中；3、CD44ICD抑制对细胞信号蛋白表达的影响10μM的DAPT处理SUDLH2、Ly3、Ly8细胞24小时后,SUDLH2、Ly3细胞Stat3表达下降,前者较后者下降明显,而Ly8细胞中Stat3基本无表达。NF-κB,在三种细胞中均有表达。DAPT处理后SUDLH2、Ly3细胞中NF-κB表达明显下降,Ly8下降不明显；4、DAPT抑制CD44ICD表达对DLBCL细胞增殖影响与对照组相比0.1μM, 1μM、10μM浓度的DAPT对两种亚型细胞无明显抑制作用,100μM的DAPT处理Ly8、SUDLH2细胞48小时后可见到明显抑制作用；5、抑制CD44ICD表达对DLBCL细胞迁移的影响10μM、100μM的DAPT处理两种亚型细胞株12小时后,与对照组相比,细胞迁移无明显变化。结论1、ABC-DLBCL来源的SUDLH2细胞株存在CD44ICD的表达；2、SUDLH2细胞株中CD44ICD处细胞浆外,主要定位于在细胞核中；3、γ分泌酶抑制剂DAPT对SUDLH2中CD44ICD的表达有抑制效果；4、CD44ICD可能参与调节ABC-DLBCL来源的细胞株Stat3、NF-κB表达；5、CD44ICD对ABC-DLBCL来源的细胞的增殖、迁移功能无明显抑制作用。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-13
前言  13-15
材料  15-20
研究方法  20-27
结果  27-33
讨论  33-36
全文小结  36-37
本文创新性  37-38
不足与展望  38-39
参考文献  39-42
综述  42-50
  参考文献  46-50
攻读学位期间发表论文情况  50-51
英文缩略词简表  51-52
致谢  52-55
统计学审稿证明  55

CD441ICD在弥漫大B淋巴瘤细胞株中作用的研究

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