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T-2毒素及其主要代谢物HT-2毒素在BeWo细胞中的胎盘转运机制研究

作　者: 王薇薇
导　师: 王玉莲
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: T-2毒素 HT-2毒素 BeWo细胞模型转运摄取转运蛋白
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

T-2毒素是镰刀菌属产生的一种A类单端孢霉烯族毒素,它是单端孢霉烯族毒素中毒性最强的一种,广泛分布于自然界,是较常见的污染谷物与粮食的主要毒素。大量体内研究表明,孕期经不同给药方式给予哺乳动物不同剂量的T-2毒素可引发严重的母体毒性和胎仔毒性。对于T-2毒素的致畸毒性作用有学者认为是其对母体的强烈毒性作用而间接导致的；但也有研究推测T-2毒素很可能通过胎盘屏障对胎鼠产生直接的毒性作用。胎盘屏障是母体血与胎儿血在胎盘内进行物质交换所通过的结构,是母体供给胎儿营养物质的唯一通道,但也是病毒、毒素、药物、激素等进入胎儿的必经之路。至今尚没有定量的研究证实T-2毒素通过胎盘屏障进入胎儿体内,并且其主要主要代谢物HT-2毒素是否也能通过胎盘屏障到达胎儿体内是未知的,而进入胎儿的T-2毒素是否会通过胎盘发生逆向的交换也是值得关注的,因此为了揭示T-2毒素在胎儿发育毒性和致畸毒性中所起到的作用,研究其在胎盘中的转运机制是十分必要的。本课题通过建立BeWo细胞模型模拟胎盘屏障,运用转运试验和摄取试验,考察T-2毒素及HT-2毒素跨胎盘屏障转运的特征,从而阐明T-2毒素的胎盘转运机制,为T-2毒素的发育毒性和致畸毒性提供合理解释。通过BeWo细胞在Transwell系统中的生长特性考察,在本实验室条件下成功建立了稳定可靠的胎盘转运细胞模型。通过三项质控标准判断模型的可靠性和稳定性,在根本上保证了试验结果的可靠性和真实性。模型考察结果显示：BeWo细胞以2.24×105 cells/mL的密度接种于Transwell中,生长到第七天细胞跨膜电阻符合要求,荧光黄通透率也符合模型的考察要求。通过在Transwell模型中进行T-2毒素和HT-2毒素的跨细胞膜转运试验,考察其双向转运特性。结果表明T-2毒素在两个方向上的转运具有显著的方向性,即吸收方向的转运速率大于分泌方向；同时两个方向的转运都具有一定的浓度依赖性,在高浓度也无法达到饱和。P-gp抑制剂剂维拉帕米、MRP抑制剂MK571以及BCRP抑制剂Ko143对T-2毒素两个方向上的转运均无显著影响。表明T-2毒素在外排方向上的转运没有主动转运蛋白的参与,推测其主要外排机制为被动扩散。HT-2毒素的转运不具有不对称性的特点,其在吸收方向的转运速率与外排方向的转运速率非常接近。并且也具有浓度依赖性,随浓度的升高,两个方向的转运速率都随比例升高。P-gp、MRP、BCRP转运蛋白抑制剂均没有对其转运造成影响。表明HT-2转运主要是以被动扩散的方式进行。通过在标准细胞培养板中进行摄取试验考察这两种毒素的从母体-胎儿方向的吸收特性,考察不同条件下BeWo细胞对这两种毒素的吸收情况来探讨他们的转运蛋白的种类。试验结果表明T-2毒素在摄取方向具有饱和特性,证明载体蛋白的存在。有机阴离子转运蛋白(OAT)抑制剂DIDS、PAH和Probencid对T-2毒素的摄取都产生了显著性抑制作用,表明OAT转运蛋白超家族参与了T-2毒素在BeWo细胞中的摄取；Cimetidine和TEA是有机阳离子转运蛋白(OCT)的抑制剂,在一定程度上也抑制了T-2毒素的摄取,表明T-2毒素的摄取有一部分是由这类转运蛋白介导。另外其Na+依赖性、质子梯度依赖性,同时其显著的pH依赖特性表明参与其转运的可能为OATP-B转运蛋白家族。多种转运蛋白同时参与T-2毒素的摄取。而HT-2的摄取不具有饱和特性,其摄取不具有Na+依赖性、质子梯度依赖性,OCT蛋白抑制剂对其摄取不产生作用,而仅OAT蛋白抑制剂对其摄取有影响,表明其主要从母体-胎儿方向的摄取方式为被动扩散。本课题在体外系统中,首次定量证实了T-2毒素和HT-2毒素可以通过胎盘屏障进入胎儿,T-2毒素在母体-胎儿方向转运显著高于从胎儿-母体,而HT-2毒素在两方向上转运速率相当；并且首次研究了胎盘中表达的几种主要转运蛋白与这两种毒素在胎盘中发生转运的关系,发现ABC外排转运蛋白在T-2毒素和HT-2毒素从胎儿-母体外排方向上的转运不参与介导作用,并且T-2毒素在母体-胎儿方向转运是一个由载体介导的主动过程,而HT-2毒素的主要转运方式为被动扩散；同时,其他几种转运体尤其是OAT转运蛋白在该类毒素的摄取中起着很重要的作用。本研究为正确评估T-2毒素在哺乳动物中的毒性作用,为可能的毒素解毒方式提供了理论依据。

全文目录

目录  5-9
摘要  9-11
Abstract  11-14
缩略语表  14-16
1 前言  16-28
  1.1 立题依据  16-27
    1.1.1 结构和理化性质  16-17
    1.1.2 T-2毒素胎儿毒性、致畸毒性与胎盘转运的关系  17-19
    1.1.3 相关转运蛋白与毒性之间的关系  19-23
    1.1.4 BeWo细胞模型的特点  23-24
    1.1.5 国内外研究进展  24-27
  1.2 研究内容和目标  27-28
    1.2.1 研究内容  27
    1.2.2 目的与意义  27-28
2 材料与方法  28-47
  2.1 药品和试剂  28-29
  2.2 溶液配制  29-32
  2.3 主要仪器和设备  32-33
  2.4 BeWo细胞  33
  2.5 BeWo细胞膜的模型的建立和评价  33-37
    2.5.1 BeWo细胞的培养  33-34
    2.5.2 BeWo细胞生长曲线的制备(MTT法)  34
    2.5.3 BeWo细胞在Transwell中的培养  34-35
    2.5.4 Transwell板鼠尾胶原的包被  35
    2.5.5 细胞生长时间的考察  35
    2.5.6 BeWo细胞模型的验证  35-37
  2.6 T-2毒素和HT-2毒素在BeWo细胞模型中的转运  37-43
    2.6.1 MTT试验  37
    2.6.2 LDH释放试验  37-39
    2.6.3 T-2毒素和HT-2毒素在BeWo细胞中的时间依赖性转运  39
    2.6.4 T-2毒素和HT-2毒素在BeWo细胞中的浓度依赖性转运  39
    2.6.5 T-2毒素和HT-2毒素在BeWo细胞中转运蛋白介导的转运  39-40
    2.6.6 LC-MS/MS法测定转运样品中T-2毒素和HT-2毒素含量  40-42
    2.6.7 表观通透率(P_(aap))的计算  42
    2.6.8 P_(atio)值的计算  42-43
    2.6.9 数据分析与处理  43
  2.7 T-2毒素与HT-2毒素在BeWo细胞中的摄取特性考察  43-47
    2.7.1 BeWo细胞在6孔板中的生长  43
    2.7.2 时间依赖性摄取  43
    2.7.3 浓度依赖性摄取  43-44
    2.7.4 温度依赖性摄取  44
    2.7.5 离子等度剂和能量抑制剂对摄取的影响  44
    2.7.6 ABC转运蛋白抑制剂对摄取的影响  44-45
    2.7.7 pH依赖性摄取  45
    2.7.8 Na~+依赖性摄取  45
    2.7.9 OAT与OCT转运蛋白抑制剂对摄取的影响  45-46
    2.7.10 样品测定  46
    2.7.11 细胞裂解和蛋白浓度的测定  46-47
    2.7.12 数据处理与分析  47
3 结果  47-65
  3.1 BeWo细胞的模型建立条件  47-50
    3.1.1 细胞生长曲线  47-48
    3.1.2 细胞接种时间的选择  48-49
    3.1.3 细胞间的紧密连接和微绒毛的分化  49-50
  3.2 T-2毒素和HT-2毒素对BeWo细胞的毒性  50-52
  3.3 分析方法的建立  52-55
    3.3.1 最低检测限与定量限  52
    3.3.2 两种毒素的标准曲线  52-53
    3.3.3 准确度与精密度  53
    3.3.4 方法的专属性  53-55
  3.4 T-2毒素和HT-2毒素在BeWo细胞中的转运特性  55-58
    3.4.1 T-2毒素和HT-2毒素在BeWo细胞中的非对称性转运  55-57
    3.4.2 ABC转运蛋白抑制剂和ATP抑制剂对转运的影响  57-58
  3.5 T-2毒素和HT-2毒素在Apcial侧的摄取特性  58-65
    3.5.1 时间对摄取的影响  58-59
    3.5.2 浓度对摄取的影响  59-60
    3.5.3 FCCP和NaN_3对摄取的影响  60-61
    3.5.4 温度对摄取的影响  61
    3.5.5 ABC外排转运蛋白抑制剂对摄取的影响  61-62
    3.5.6 pH值对摄取的影响  62-63
    3.5.7 Na~+和Cl~-对摄取的影响  63
    3.5.8 OAT抑制剂和OCT抑制剂对摄取的影响  63-65
4 讨论  65-71
5 全文总结  71-72
6 文献综述:单端孢A类毒素研究现状与趋势  72-89
  6.1 单端孢A型毒素的结构特点和生物合成  73-75
  6.2 单端孢A型毒素的产毒菌种  75-76
  6.3 单端孢A类毒素的检测方法  76-80
    6.3.1 提取纯化及结构鉴定  76-77
    6.3.2 检测方法  77-80
  6.4 单端孢A型毒素在不同地区的存在状况  80-82
  6.5 单端孢A型毒素毒理学研究  82-87
    6.5.1 急性毒性  83
    6.5.2 遗传毒性  83-84
    6.5.3 致畸毒性和繁殖毒性  84-85
    6.5.4 慢性、亚慢性和致癌毒性  85-86
    6.5.5 细胞毒性和免疫毒性  86-87
  6.6 研究趋势和展望  87-89
参考文献  89-113
致谢  113-114
作者简介  114-115
附录  115-119

T-2毒素及其主要代谢物HT-2毒素在BeWo细胞中的胎盘转运机制研究

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