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野生大豆核基因组可转化人工染色体（TAC）文库的构建

作　者: 李克秀
导　师: 李晓玲；董英山
学　校: 长春工业大学
专　业: 食品科学
关键词: 野生大豆可转化人工染色体基因组文库脉冲交变电场电泳
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

高质量的载体DNA和大片段基因组DNA是植物大片段基因组文库构建的两个基本要素,二者将对后续连接转化反应效率及插入片段长度起到关键性决定作用。本实验选用野生大豆黄化幼苗为材料,以可转化人工染色体(transformation-competent artificial chromosome TAC) pYLTAC747NH/sacB为文库载体,对其核基因组可转化人工染色体文库构建技术和条件进行摸索和优化。结果表明：该文库载体经碱裂解法提取、QIAGEN Plasmid Mini kit纯化后,可获得较纯净的载体DNA。对其闭环载体DNA分别用不同酶量的HindⅢ酶切处理,经琼脂糖凝胶电泳检测得出其最佳HindⅢ完全酶切条件为：HindⅢ闭环载体DNA、37℃酶切30min。分别用0.5MBU和1MBU HK脱磷酶对其线性载体DNA进行脱磷处理,经电泳和载体自连产物电转化检测表明其适宜的完全脱磷条件为：1MBU HK脱磷酶/μg线性载体DNA,30℃脱磷1h,获得线性脱磷载体DNA浓度为20-25ng/μL;本实验采用过滤和离心的方法提取野生大豆黄化苗细胞核DNA,经LMP包埋并用蛋白酶K裂解其中的核蛋白后,采用脉冲电泳回收2Mb左右细胞核DNA。用HindⅢ对回收的细胞核DNA进行部分酶切并用脉冲电泳分组回收酶切后的DNA片段,经电洗脱、浓缩和透析后DNA溶液浓度可达10ng/μL;将处理好的载体和野生大豆核基因组DNA部分酶切片段在T4连接酶的作用下,通过优化连接体系和连接程序获得连接产物。将连接产物膜透析、经电击转化大肠杆菌DH10B感受态细胞后,用LB+Kan25mg/L+5%Sucrose平板筛选获得阳性克隆,转化频率可达到1.92×108个/mgDNA。利用该技术,已成功获得3万左右的阳性克隆,插入片段平均在20-40Kb,将筛选得到的阳性克隆用384孔板于-80℃保存效果很好。

全文目录

摘要  2-3
ABSTRACT  3-5
第一章绪论  5-15
  1.1 本课题的来源及研究意义  5-6
  1.2 野生大豆概述  6-9
  1.3 植物基因组文库概述  9-15
第二章材料与方法  15-26
  2.1 实验材料  15
  2.2 实验方法  15-26
第三章结果与分析  26-38
  3.1 PYLTAC747NH/SACB载体的制备与检测  26-33
  3.2 野生大豆细胞核DNA的提取及部分酶切  33-35
  3.3 连接与转化检测结果  35-37
  3.4 阳性克隆的保存  37-38
第四章讨论  38-40
  4.1 关于PYLTAC747NH/SACB载体的制备与检测  38-39
  4.2 关于野生大豆细胞核大片段DNA的提取和部分酶切条件  39
  4.3 载体与酶切片段DNA的连接与转化条件优化  39-40
结论  40-41
致谢  41-42
参考文献  42-46
附录1  46-47
附录2  47-52
攻读硕士学位期间研究成果  52-53

野生大豆核基因组可转化人工染色体（TAC）文库的构建

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