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利用双荧光素酶报告基因系统检测猪miR-369与TNF-α基因的靶标关系

作　者: 邓娟
导　师: 李学伟
学　校: 四川农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪 miRNA 肿瘤坏死抑制因子-α(TNF-α) 腺嘌呤/尿嘧啶富集元件(AU-rich element，AREs) AUUUA五聚体 mRNA稳定性双荧光素酶报告基因系统
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本实验通过猪与人TNF-α基因序列相似性的比对,及与猪miR-369第2-8位种子序列相匹配的靶位点的寻找和对比,预测猪miR-369同样调节TNF-α基因的表达。为了验证这一结果,本实验利用双荧光素酶报告基因系统去检测猪miR-369与TNF-α基因的靶标关系。结果显示：(1) TNF-α基因在人、猪、大鼠、小鼠、牛和家兔中,均具有较高的相似性,其中猪与牛的相似性最高,与人次之。(2)猪与人的TNF-α基因中,3’UTR区域含有相同核苷酸数目(34 nt)的AREs,且相似性极高。经miR-369第2-8位种子序列碱基匹配预测,在AREs区域两者含有两个相似性极高的miR-369的靶位点。(3)野生型重组质粒(WT)和突变型重组质粒(MT)构建成功,即野生型的AREs序列和靶位点突变的突变型AREs序列均按正确方向,成功地连接到了双荧光素酶报告基因质粒载体psiCHECKTM-2上。(4)在对猪髋动脉内皮细胞(PIEC)进行转染时,只有当细胞生长融合度到90%,mimics (miRNA模拟物)与质粒载体共转染的最终浓度分别为50 nM和150 ng时,才能达到最优的转染效果。(5)单转染的突变型重组质粒(MT)与野生型重组质粒(WT)相比,差异极显著,P<0.01,即MT的荧光比值极显著高于WT的荧光比值,表明AREs影响mRNA的稳定性。由于MT比WT少了三个连续的AUUUA五聚体,说明AUUUA五聚体与mRNA稳定性密切相关,且推测mRNA的稳定性可能与AUUUA五聚体的连续性成正相关。即相同个数的AUUUA五聚体,连续性越好,其影响mRNA稳定性越强；连续性越小,其影响mRNA稳定性越弱。(6) miRNA过表达时(C组,mimics+WT),其荧光比值极显著低于对照组(control, WT), P<0.01,表明ssc-miR-369抑制了海肾荧光素酶的表达,即ssc-miR-369下调TNF-α基因的表达。(7) miRNA抑制时(D组,inhibitor+WT),其荧光比值与对照组control相比,P>0.05,差异不显著；与C组相比,P<0.05,差异显著。进一步证实了miR-369对TNF-α靶基因的下调作用。(8)在转录后水平调节mRNA的过程中,AREs与miRNA具有一些相似之处。但当共处时,它们的调节作用互不干扰,或者说影响很少,即使当miRNA的靶位点位于AREs区域中时也一样。(9)本研究的成功表明了一种筛选动物功能基因的新的途径,能更好地把人类和小鼠等物种上的取得的一些研究成果借鉴到我们动物生产上来,同时本研究还可能为AREs (AU-rich elements)和miRNAs(微小RNA, microRNA)的基础研究提供了一些有用的参考数据。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
1 文献综述  11-27
  1.1 肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF)的研究进展  11-16
    1.1.1 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的来源及表达  11
    1.1.2 TNF-α的基因序列及其分子结构  11-12
    1.1.3 TNF-α受体(TNFR)的分类及表达  12
    1.1.4 TNF-α的生物学功能及其研究进展  12-16
  1.2 微小RNA(microRNA,miRNA)的研究进展  16-22
    1.2.1 miRNA的生物合成  16-17
    1.2.2 miRNA的特征  17-18
    1.2.3 miRNA的作用机制  18-20
    1.2.4 动物体miRNA与siRNA的区别  20-21
    1.2.5 miRNA的生物学意义及其研究进展  21-22
  1.3 miRNA靶基因的鉴定  22-24
    1.3.1 鉴定miRNA靶基因的方法  22-23
    1.3.2 双荧光素酶报告基因系统鉴定miRNA靶基因的原理及优势  23-24
  1.4 mRNA的降解途径  24-26
    1.4.1 mRNA的主要降解途径  24-25
    1.4.2 ARE调控mRNA稳定性的机制  25
    1.4.3 mRNA的其它降解途径及研究进展  25-26
  1.5 本实验研究的目的和意义  26-27
2 材料和方法  27-39
  2.1 主要仪器设备  27-28
  2.2 实验所需试剂  28-29
  2.3 常用试剂的配制  29
  2.4 实验方法  29-39
    2.4.1 miRNA的预测  29-30
    2.4.2 目的片断序列的设计及PCR钓取  30-31
    2.4.3 琼脂凝胶回收  31-32
    2.4.4 双酶切PsiCHECKTM-2载体  32-33
    2.4.5 目的片断与载体连接  33
    2.4.6 连接产物的转化  33-34
    2.4.7 重组质粒的检测与抽提  34-35
    2.4.8 转染条件的优化  35-37
    2.4.9 共转染及双荧光素酶报告基因活性检测  37-39
3 结果与分析  39-47
  3.1 miRNA的预测  39-40
    3.1.1 猪与其他哺乳动物标准序列的同源性比对  39
    3.1.2 miRNA靶位点序列的比对  39-40
  3.2 重组质粒测序结果与分析  40-41
  3.3 重组质粒载体的提取  41-42
  3.4 转染条件的优化  42-44
    3.4.1 Mimics转染条件的优化  42-44
    3.4.2 pEGFP-N3质粒转染条件的优化  44
  3.5 双荧光素酶报告基因活性检测  44-47
4.讨论  47-52
  4.1 AREs负调控mRNA的表达  47-48
  4.2 ssc-miRNA-369负调控靶位点位于AREs上的TNF-a基因  48-49
  4.3 miRNAs与AREs的相关性研究  49-52
5 结论  52-53
6 参考文献  53-61
致谢  61

利用双荧光素酶报告基因系统检测猪miR-369与TNF-α基因的靶标关系

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