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新型生物人工肝免疫安全性的实验研究

作　者: 张悦
导　师: 丁义涛
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: 生物人工肝急性肝功能衰竭猪肝细胞骨髓间充质干细胞纳米纤维支架膜截流分子量免疫安全性
分类号: R318.14
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：探讨膜截流分子量对新型生物人工肝支持系统免疫安全性的影响方法：应用D氨基半乳糖静脉滴注比格犬建立急性肝功能衰竭模型。采用猪肝细胞-骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）共培养体系作为种子细胞，以基于乳糖酰基壳聚糖纳米纤维支架的多层平板作为反应器，构建新型生物人工肝（bioartificial liver, BAL）。急性肝功能衰竭犬根据BAL中血浆成分分离柱内半透膜截流分子量的大小分为两组：A组：200KD组；B组：1200KD组，各组均接受新型2次BAL治疗，时间点为第1天和第21天，每次6小时。观察各组体内IgG、IgM、CH50变化及反应器内抗体漏过情况。免疫组化检测各组动物模型心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中IgG、IgM及补体C3沉积情况。结果：在第一次BAL治疗后两组的IgG和IgM水平均没有发生明显的变化；而在第2次治疗后的第7天，1200KD组的IgG和IgM水平出现明显的升高，200KD组的IgG和IgM水平仍未出现明显上升或下降。CH50的结果显示，在第一次BAL治疗后，两组的CH50都出现了暂时性的下降，在治疗后1小时达到最低值，而后缓步上升，在7天后恢复至治疗前水平。反应器内培养液中IgG、IgM及CH50检测结果显示，1200KD组在治疗结束后IgG、IgM及CH50含量显著高于200KD组。采用免疫组化技术对所有犬心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏等重要器官检测抗体沉积情况后发现，各重要脏器均未检测有IgG、IgM及补体C3的沉积结论：膜截流分子量可能是影响BAL异种免疫排斥的重要因素之一。目的：探索膜截流分子量对新型生物人工肝支持系统内细胞材料功能的影响方法：以基于乳糖酰基壳聚糖纳米纤维支架的多层平板作为生物反应器，猪肝细胞-骨髓间充质干细胞共培养体系作为核心细胞材料，构建新型生物人工肝。首先采用免疫荧光染色及逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）观察离体猪肝细胞、骨髓间充质干细胞表面是否表达异种抗原Galα(1,3) Gal；然后依据新型BAL中血浆成分分离柱内半透膜截流分子量的大小分为两组：200KD组；1200KD组。动物模型采用正常比格犬，各组均接受新型BAL治疗6小时，定时收集BAL系统中培养液。检测各组反应器内细胞材料清蛋白、尿素表达水平，同时观察各组反应器内细胞活力及细胞损伤情况。结果：荧光显微镜观察发现猪肝细胞和骨髓MSCs在体外培养过程中仍然能稳定表达Galα(1,3) Gal。RT-PCR结果显示离体猪肝细胞、骨髓MSCs和共培养细胞内均存在ggta-1mRNA序列。细胞功能检测结果显示，200KD组细胞清蛋白分泌水平及尿素合成分别为53.3ug/10~6细胞和3.6ug/10~6细胞，显著高于1200KD组的5.6ug/10~6细胞和0.3ug/10~6细胞。细胞活力观测结果显示200KD组细胞活力保持在90%左右，明显高于1200KD组的22％；细胞损伤结果提示1200KD组反应器内AST含量从13.3U/L上升至60.2U/L，200KD组浓度则在13.2-14.8U/L之间波动；LDH结果与之类似。反应器内免疫球蛋白分子含量检测结果发现200KD组在循环开始3小时后才检测出微量的IgG，直至实验结束其含量稳定在0.004-0.005mg/ml之间；而1200KD组从循环开始后30分钟的0.4mg/ml上升至2.7mg/ml。两组结果具有统计学差异（P<0.05）。CH50的检测结果表现出类似的趋势。200KD组在6小时的体外循环灌注过程中未能检测出IgM，1200KD组则从开始后30分钟的0.7mg/ml上升至结束时的2.3mg/ml。免疫荧光试验进一步证实了上述结果。结论：降低BAL膜截流分子量可以有效减少免疫球蛋白分子的透过，从而维持BAL中细胞材料的功能。第三部分新型生物人工肝治疗应用的免疫安全性研究目的：探讨新型生物人工肝系统治疗急性肝功能衰竭犬模型的免疫安全性。方法：采用基于乳糖酰基壳聚糖纳米纤维支架的多层平板生物反应器与猪肝细胞-骨髓间充质干细胞构建新型的BAL系统。其中血浆成分分离柱内半透膜截流分子量为200KD。D氨基半乳糖诱导建立犬急性肝功能衰竭模型。根据治疗次数的不同，实验犬被分成两组，1组：接受1次BAL治疗；2组：接受3次BAL治疗，每次治疗时间6小时。治疗期间对动物血流动力学及血液动力学进行监测。ELISA法检测血浆及培养液中IgG，IgM及CH50水平。免疫荧光片检测心、肝、脾、肺、肾等器官及反应器内细胞材料表面免疫蛋白的沉积情况。结果：治疗期间，每条实验犬的心率、血压及呼吸频率平稳，血常规检测显示，白细胞、血小板及淋巴细胞未出现明显的升高或降低。犬在接受1次BAL治疗后，体内IgG，IgM免疫抗体水平未出现明显的升高或下降，而补体CH50水平出现一过性下降，但很快恢复至正常水平，且并未发生严重的过敏反应及排斥反应。接受3次BAL治疗的实验犬体内IgG、IgM和CH50水平的变化规律亦表现出类似的现象。反应器内培养液中IgG，IgM及CH50检测结果显示，前3h内未能检测出IgG与CH50，3h及6h两个时间点检出极其少量的IgG与CH50。6h内均未检测出IgM。免疫荧光的结果与ELISA检测结果类似；循环结束后反应器内细胞材料表面免疫复合物检测有微量的IgG与补体C3沉积，但未能检测出IgM各重要脏器均未检测到IgG，IgM及补体C3的沉积。结论：新型BAL行实验性治疗具有良好的免疫安全性。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-12
前言  12-18
第一部分膜截流分子量在新型生物人工肝免疫安全性中的作用研究  18-38
  1、引言  18
  2、材料和方法  18-28
  3、结果  28-34
  4、讨论  34-35
  5、结论  35-36
  参考文献  36-38
第二部分膜截流分子量对新型生物人工肝内细胞材料影响的实验研究  38-52
  1、引言  38
  2、材料和方法  38-43
  3、结果  43-49
  4、讨论  49-50
  5、结论  50
  参考文献  50-52
第三部分新型生物人工肝治疗应用的免疫安全性研究  52-66
  1、引言  52
  2、材料和方法  52-56
  3、结果  56-62
  4、讨论  62-63
  5、结论  63-64
  参考文献  64-66
文献综述一  66-83
  参考文献  72-83
文献综述二  83-101
  参考文献  87-101
攻读学位期间发表文章情况  101-102
致谢  102

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