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力学作用下微、纳米HA/CS共混体系中微观结构参数对成骨前体细胞MC3T3-E1生物学特性的影响

作　者: 李瑞欣
导　师: 张西正
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: 羟基磷灰石 壳聚糖 复合材料 MC3T3-E1细胞 循环压载荷
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


研究背景和目的作为身体的支撑框架，骨组织在整个生命过程中不断地受到各种力的作用而相应地调节其质量、密度和内部结构。成骨细胞是对应力应变信号进行感知的主要力学敏感性细胞。骨缺损的修复及组织工程化骨组织的构建，成骨细胞都是在三维支架内部贴壁生长的。支架材料作为接受外来刺激的主体，将力学刺激从外部传递到细胞，而细胞因为受到力学刺激，其增殖和分化的速率也将会发生改变。因此，研究支架在表观应变下内部的应变分布对于研究力学刺激对三维支架内细胞的增殖及分化具有重要的意义。Micro-CT技术能够非破坏性的获得支架内部结构数据，通过这些数据进行重建获得支架的模型，再用有限元分析不同的力学刺激下支架内部的应变分布。在骨移植材料和骨组织工程支架材料中，羟基磷灰石（Hydroxyapatite, HA）因能与骨形成很强的化学结合具有骨传导作用而被广泛应用，然而，单一HA的脆性及低疲劳强度限制了其进一步应用，壳聚糖（Chitosan，CS）因具有无毒性、可生物降解及良好的可加工性而被广泛应用于组织工程研究中，将HA与CS复合从而增强韧性，并充分发挥HA良好的生物相容性，有望制备出性能优异的骨支架材料。本研究拟制备微、纳米HA并与CS共混制备复合膜及多孔支架材料，考察力学刺激对MC3T3-E1细胞在微、纳米HA/CS复合膜及多孔支架上的生物学特性的影响。为骨移植材料的研制、组织工程骨的体外构建提供一定的理论依据和新方法。研究方法（1）通过将猪骨脱脂脱蛋白、煅烧再球磨的方法制备微米级HA，通过超声、搅拌的方法制备纳米级HA。将微、纳米级HA与CS共混制备复合膜，对复合膜进行理化性能、细胞相容性测试，考察MC3T3-E1细胞在微、纳米HA/CS复合膜上的增殖和凋亡，优选制备三维多孔支架材料的配比。（2）以石蜡微球为致孔剂，通过与HA/CS共混溶液混合后铸模、粒子导出方法制备复合多孔支架材料。对制备的复合支架材料进行动态力学性能测试及SEM形貌观察，将成骨前体细胞MC3T3-E1细胞接种到支架上，考察支架材料的细胞相容性；对支架进行Micro-CT扫描获得微观结构参数，并考察复合支架的体外酶解过程。（3）应用Micro-CT扫描得到的材料结构参数，有限元建模后分析材料在施加不同的表观应变时内部的应变分布，优选出适合的表观应变。对细胞/支架复合物施加波形为正弦波、频率为1Hz、表观应变3000με的动态压载荷、10min/次，1次/d，7d、14d后进行相关检测：SEM观察细胞在支架上受力后的形态变化，检测细胞增殖、凋亡，ELISA检测ALP含量，Real-time PCR检测BMP-2、Col I、OCN mRNA表达，Western blot检测BMP-2、Col I、OCN蛋白含量。实验结果（1）通过对松质骨脱脂脱蛋白再煅烧、球磨的方法，可以获得粒径较为均一的微米级天然HA粒子，中值粒径D50在1.21～1.67范围内。采用超声、搅拌的方法制备了纳米级的直径约5nm、长约50nm的棒状HA粒子。将微、纳米HA与CS共混制备HA/CS复合膜，SEM显示HA在基质CS中分布较均匀，二者结合紧密，复合膜具有较好的力学性能，在CS中加入HA可以克服HA的颗粒流动性的缺点。比较球磨工艺及原料配比对成骨前体细胞MC3T3-E1增殖及形态的影响，优选出9号复合膜的配比制备下一步的多孔支架，细胞在微、纳米HA/CS复合膜上的增殖、凋亡没有统计学差异。在复合膜材料上检测细胞相容性更加直观，为下一步制备多孔支架材料提供了理论依据。（2）以石蜡微球为致孔剂通过粒子导出方法制备了微、纳米级HA/CS复合支架材料，随着致孔剂含量的增加，支架的孔隙连通性增加。实验证实，球形致孔剂制备的支架在孔隙连通性方面较立方体致孔剂更具有优势。对复合支架分别进行动态力学性能测试，支架表现出粘弹性和滞后效应。综合力学性能和SEM结果，优选复合溶液与石蜡微球比例为50:70的支架为下一步实验用支架。经Micro-CT扫描后获得的微、纳米HA/CS复合支架的微观结构参数基本一致，将Micro-CT扫描后获得的图像在Mimics中建模，可以看出制备的支架具有良好的孔隙连通性。微、纳米HA/CS复合支架具有良好的细胞相容性，成骨前体细胞MC3T3-E1能在支架孔壁上黏附、增殖。微、纳米HA/CS复合支架在溶菌酶的PBS溶液中可以发生降解，在前4w降解速率较低，在4～8w降解速率大大提高，降解液中有还原糖生成，且其含量随降解时间的延长呈增大趋势。（3）用基于Micro-CT的有限元方法，计算了不同表观应变下复合支架内部的应变分布，存在应力集中现象，计算出应施加的最佳表观应变为3000με。对细胞/支架复合物施加动态压载荷后，SEM结果表明细胞在微、纳米HA/CS支架上可黏附、增殖，7d时细胞呈梭形、不规则状，有部分集落，14d细胞逐渐融合成片，几乎长满支架表层的孔隙。Real-time PCR和Western结果显示ColⅠmRNA及蛋白表达在14d均高于对照组，而OCN蛋白表达在7d、14d与对照组无显著性差异，表明细胞还未完全分化成熟。ALP蛋白表达在7d时明显升高，14d时又下降。实验结果显示基因mRNA达与蛋白表达二者间并没有完全的一致性。结论（1）通过球磨法可制备微米级HA粒子，通过超声、搅拌的方法可制备出纳米级HA粒子，但将二者与CS共混成膜后尺度效应不够明显，对MC3T3-E1细胞的黏附、增殖、凋亡无明显影响，可能是HA发生团聚所致。（2）应用石蜡微球做致孔剂可以得到孔隙连通性良好的微、纳米HA/CS复合支架材料，随着致孔剂含量的增加，支架的孔隙连通性增加。同法制备的微、纳米HA/CS复合支架材料的微观结构参数基本一致。微、纳米HA/CS复合支架在溶菌酶的PBS溶液中可以发生降解，在4～8w降解速率大大提高，降解液中还原糖含量随降解时间的延长呈增大趋势。（3）应用基于Micro-CT的有限元方法，可分析不同表观应变下复合支架内部的应变分布，计算出利于细胞生长的最佳表观应变。循环压载荷促进了微、纳米复合支架内MC3T3-E1细胞的BMP-2、ColⅠ的mRNA蛋白表达，但对于OCN蛋白表达无显著影响。

全文目录


缩略词索引表  9-11
摘要  11-14
ABSTRACT  14-18
第1章 绪论  18-27
  1.1 研究背景  18-21
  1.2 课题的目的意义  21-22
  1.3 研究内容与研究方法  22
  1.4 课题实施方案  22-23
  1.5 参考文献  23-27
第2章 微、纳米 HA/CS 复合膜的制备及性能  27-55
  2.1 引言  27-28
  2.2 材料与方法  28-38
    2.2.1 细胞  28
    2.2.2 主要试剂  28-29
    2.2.3 主要仪器  29
    2.2.4 试剂的配制  29-30
    2.2.5 实验方法  30-38
      2.2.5.1 微米 HA 的制备及表征  30-31
      2.2.5.2 纳米 HA 的制备及表征  31-32
      2.2.5.3 微、纳米 HA 的能谱分析比较  32
      2.2.5.4 微、纳米 HA/CS 复合膜的制备  32-33
      2.2.5.5 微、纳米 HA/CS 复合膜的性能  33-38
    2.2.6 统计学处理  38
  2.3 实验结果  38-51
    2.3.1 微米 HA 的制备及表征  38-41
    2.3.2 纳米 HA 的制备及表征  41-44
    2.3.3 微、纳米 HA 的能谱分析比较  44
    2.3.4 微、纳米 HA/CS 复合膜的力学性能  44-46
    2.3.5 微、纳米 HA/CS 复合膜的细胞相容性  46-51
      2.3.5.1 小鼠成骨前体细胞 MC3T3-E1 的培养及鉴定  46-47
      2.3.5.2 MC3T3-E1 细胞在复合膜上的增殖  47-48
      2.3.5.3 SEM 观察复合膜上细胞形态  48-50
      2.3.5.4 力学拉伸对复合膜上细胞凋亡的影响  50-51
  2.4 讨论  51-53
  2.5 结论  53
  2.6 参考文献  53-55
第3章 微、纳米 HA/CS 复合多孔支架材料的制备及性能  55-84
  3.1 引言  55-56
  3.2 材料与方法  56-61
    3.2.1 细胞  56-57
    3.2.2 主要试剂  57
    3.2.3 主要仪器  57-58
    3.2.4 实验方法  58-61
      3.2.4.1 致孔剂石蜡微球的制备及形貌观察  58
      3.2.4.2 复合支架的制备  58-59
      3.2.4.3 复合支架的理化性能  59
      3.2.4.4 复合支架的细胞相容性  59-60
      3.2.4.5 复合支架的体外降解  60-61
  3.3 实验结果  61-78
    3.3.1 致孔剂石蜡微球的制备及形貌观察  61-62
    3.3.2 复合支架的理化性能  62-71
      3.3.2.1 SEM 观察  62-64
      3.3.2.2 复合支架的吸水率  64
      3.3.2.3 复合支架的动态力学性能  64-68
      3.3.2.4 复合支架三维结构及微观结构参数  68-71
    3.3.3 复合支架的细胞相容性  71-73
      3.3.3.1 细胞增殖  71-72
      3.3.3.2 细胞/支架复合物 H.E、Masson 染色  72
      3.3.3.3 SEM 观察细胞形态  72-73
    3.3.4 复合支架的体外降解  73-78
      3.3.4.1 复合支架质量变化  73-74
      3.3.4.2 SEM 观察表面溶蚀  74-76
      3.3.4.3 降解液中还原糖浓度  76-78
  3.4 讨论  78-79
  3.5 结论  79-80
  3.6 参考文献  80-84
第4章 力学作用对微、纳米 HA/CS 复合材料上 MC3T3-E1 生物学特性的影响  84-117
  4.1 引言  84
  4.2 材料与方法  84-100
    4.2.1 细胞  84-85
    4.2.2 主要试剂  85-86
    4.2.3 主要仪器  86-87
    4.2.4 主要试剂的配制  87-88
    4.2.5 实验方法  88-99
      4.2.5.1 细胞/支架复合物动态载荷参数的确定  88
      4.2.5.2 动态压载荷加载装置的完善及使用  88-94
      4.2.5.3 细胞的接种及动态培养  94
      4.2.5.4 SEM 观察细胞形态  94
      4.2.5.5 MTT 法检测细胞增殖  94
      4.2.5.6 流式细胞术检测细胞凋亡  94
      4.2.5.7 ELISA 检测细胞 ALP 含量  94-95
      4.2.5.8 Real-time PCR 检测细胞 BMP-2、Col I、OCN 基因表达  95-98
      4.2.5.9 Western blot 检测细胞 BMP-2、Col I、OCN 蛋白表达  98-99
    4.2.6 统计学处理  99-100
  4.3 结果与讨论  100-110
    4.3.1 细胞/支架复合物动态载荷参数的确定  100-103
    4.3.2 动态压载荷加载装置的完善及使用  103
    4.3.3 SEM 观察细胞形态  103-105
    4.3.4 MTT 法检测细胞增殖  105
    4.3.5 流式细胞术检测细胞凋亡  105-106
    4.3.6 ELISA 检测细胞 ALP 含量  106-107
    4.3.7 Real-time PCR 检测细胞 BMP-2、Col I、OCN 基因表达  107-109
    4.3.8 Western blot 检测细胞 BMP-2、Col I、OCN 蛋白表达  109-110
  4.4 讨论  110-112
  4.5 结论  112-113
  4.6 参考文献  113-117
第5章 结论与后续工作建议  117-119
  5.1 全文主要结论  117-118
  5.2 后续工作建议  118-119
文献综述  119-129
  参考文献  125-129
在学期间取得的成果及发表的代表性论著  129-131
附件  131-139
作者简历  139-140
致谢  140

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医用一般科学 > 生物医学工程 > 一般性问题 > 生物材料学
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