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淋巴靶向抗癌药物卡波霉素载体制备方法优化及药效研究

作　者: 张浩
导　师: 张英鸽
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 活性炭纳米粒子丝裂霉素C 抑制肿瘤生长减轻毒性作用
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 33次
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内容摘要

目的:对活性炭纳米粒子(ACNP)吸附丝裂霉素C(MMC)所制备的新药卡波霉素(CBMC)的载体制备方法进行优化并对其药效进行研究。材料和方法:采用球磨悬浮沉淀法制备MMC的靶向载体ACNP;通过透射电镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)对其粒径和形态进行表征;将一定配比的ACNP与MMC超声混悬吸附,测不同时间点未被吸附的MMC的量,以吸附曲线转弯点的切线与平台线的交叉点处的时间作为吸附达平衡时间;将不同配比的ACNP和MMC混悬液吸附达平衡后,测未被吸附的MMC的量,通过等温吸附公式确定ACNP与MMC的最佳配比。体外以恒温摇床、透析装置和磷酸盐缓冲溶液(PBS)模拟体内环境对CBMC的释药特性进行分析研究。以甲基噻唑蓝(MTT)法研究CBMC对体外培养人胃癌BGC-823细胞株、人食管癌EC-109细胞株、人结肠癌HCT-8细胞株和人肝癌SMMC-7701细胞株的生长抑制作用。实验设生理盐水对照组、浓度分别为0.2、1、5、25、50、100、200、400、800μg/ml的CBMC实验组和相同浓度梯度的MMC溶液(CBMC组剂量按含MMC的量计);体内常规动物模型实验研究CBMC对小鼠肉瘤S180模型的抑瘤率和对小鼠腹水型肝癌H22模型的生命延长率;构建能够稳定表达荧光素酶的BGC-823-luc细胞株,并对裸鼠腹腔和皮下接种构建肿瘤模型,通过IVIS活体成像系统研究CBMC对生物体自发光肿瘤模型肿瘤生长的抑制作用,考察CBMC与MMC相比其体内抗肿瘤作用是否有显著性差异。实验分组上,常规动物实验和活体动物实验均设生理盐水对照组、1mg/kg MMC组、ACNP对照组、0.33mg/kg CBMC组、1mg/kg CBMC组和3mg/kg CBMC组(CBMC组剂量按含MMC的量计);将CBMC与MMC分别分0.02、0.04、0.08、0.10、0.16、0.20、0.40mg不同剂量组给小鼠皮下注射给药(CBMC组剂量按含MMC的量计),构建组织损伤模型。以损伤出现时间、损伤面积大小和愈后情况为指标,考察CBMC与MMC相比能否减轻对组织的损伤作用。结果:球磨悬浮沉淀法制备的ACNP颗粒大小均匀、形状规则、近似球状、表面光滑,平均粒径为60±20nm;紫外可见分光光度计全波长扫描结果显示,MMC在217nm和365nm吸收较强,且在365nm处吸收较为稳定,故实验中选择MMC的测定波长为365nm。在0.1-20mg/L的浓度范围内,MMC的吸光度A与其浓度C呈直线正相关,回归方程为A=0.00421+0.06591C(r=0.99987,P<0.0001)。在25℃时,25min左右ACNP吸附MMC达到平衡状态,且随着时间的延长吸附量不再发生明显变化;室温条件下,所得等温方程式为C/X= -0.0123+0.00506C(r=0.99916,P<0.0001),ACNP对MMC的饱和吸附量Xm=199.63mg/g。1gACNP吸附199.63mgMMC达到饱和。故配制CBMC时MMC与ACNP质量比为1:5。CBMC体外释放实验结果显示,MMC对照组8h累积释放量为98%,CBMC释放28d累积释放量为70.15%,缓释效果明显。体外细胞实验中,与阴性对照组相比,对于所选取的四种细胞,含有相同剂量MMC的CBMC组与单纯使用MMC组抑瘤率相比,抑瘤效果明显,结果具有统计学意义,各组之间的统计结果P值大都维持在0.001以下,ACNP组与阴性对照组相比抑瘤率均没有显著性差异。体内动物实验中,小鼠肉瘤S180模型抑瘤率实验,与生理盐水对照组瘤重相比,1mg/kg MMC组、0.33mg/kg CBMC组、1mg/kg CBMC组和3mg/kg CBMC组均显著性减小,统计结果有显著性差异(P<0.001),ACNP组瘤重没有显著性差异;与1mg/kg MMC组相比,1mg/kg CBMC组和3mg/kg CBMC组瘤重均显著性减小,统计结果有显著性差异(P<0.001);小鼠腹水型肝癌H22模型生命延长率实验中,与生理盐水对照组相比,1mg/kg MMC组、0.33mg/kg CBMC组、1mg/kg CBMC组和3mg/kg CBMC组小鼠的生存时间均显著性延长,有统计学意义(P<0.001),ACNP组没有显著性差异;与1mg/kg MMC组相比,1mg/kg CBMC组和3mg/kg CBMC组小鼠生存时间均显著性延长,有统计学意义(P<0.01和P<0.001)。活体成像动物模型实验中,构建的BGC-823-luc肿瘤细胞体内外表达荧光强度高且稳定,荧光强度与肿瘤细胞数目呈正比;将转染后的BGC-823-Luc细胞裸鼠腹腔和皮下接种7d后IVIS活体成像系统观测,发现明显癌灶,提示肿瘤模型建立成功;裸鼠腹腔胃癌BGC-823-luc肿瘤模型建立后,给药后7d,与阴性对照组相比,四组给药组荧光值均具有显著性差异(P<0.05);与1mg/kg MMC组相比,3mg/kg CBMC组荧光值有显著性减小,统计结果有显著性差异(P<0.05)。给药后14d和21d,四组给药组荧光值较生理盐水对照组均具有显著性差异(P<0.01);与1mg/kg MMC组相比,1mg/kg CBMC组、3mg/kg CBMC组荧光值均显著性减小,统计结果有显著性差异(P<0.01);裸鼠皮下胃癌BGC-823-luc肿瘤模型建立后,给药后7d,与生理盐水对照组相比,四组给药组荧光值均具有显著性差异(P<0.05),与1mg/kg MMC组相比,3mg/kg CBMC组荧光值有显著性差异(P<0.05);给药后14d和21d,四组给药组荧光值均具有显著性差异(P<0.01),与1mg/kg MMC组相比,1mg/kg CBMC组、3mg/kg CBMC组荧光值有显著性差异(P<0.01)。小鼠皮下MMC所致组织损伤实验中,与MMC组相比,含有相同剂量MMC的CBMC组损伤出现的时间较晚,损伤面积显著性减少,有统计学差异(P<0.01);CBMC组小鼠创面愈合较快,28d后已基本痊愈,且创面重新生长出毛发。结论:本实验室通过球磨悬浮沉淀法制备出的活性炭纳米粒子与市售的相比,颗粒小且均匀,质量可控,可批量生产;MMC与ACNP混合吸附配比为1:5,吸附时间为25min;CBMC具有明显的缓释效应,突释效应不明显;含有相同剂量MMC的CBMC体外对人胃癌BGC-823细胞株、人食管癌EC-109细胞株、人结肠癌HCT-8细胞株和人肝癌SMMC-7701细胞株的抑制作用均好于单独使用MMC,活性炭本身没有杀伤细胞的作用,但可显著增强MMC的体外抑制细胞生长的作用;体内动物实验表明,与单独使用MMC相比,CBMC能显著增强对S180肉瘤小鼠的肿瘤抑制率,明显延长H22腹水型肝癌小鼠的生存时间,显著抑制腹腔和皮下种植人胃癌BGC-823-luc细胞裸鼠的肿瘤生长,能够有效抑制肿瘤的转移和复发;组织损伤实验结果表明,与单独使用MMC相比,CBMC对小鼠皮下组织造成的损伤程度明显减小,ACNP吸附MMC后能够显著减小MMC对组织的损伤作用。

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