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低聚甘露糖醛酸升高白细胞作用及机理研究

作　者: 李海花
导　师: 管华诗
学　校: 中国海洋大学
专　业: 药物化学
关键词: 低聚甘露糖醛酸白细胞减少症骨髓有核细胞数骨髓基质细胞粒-巨噬系造血祖细胞集落粒-巨噬系集落刺激因子干细胞因子白介素-3 荧光标记
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

白细胞减少症是肿瘤放化疗过程中常见的一种并发症，是指外周血液中的白细胞数目持续低于4×109个/L，临床表现主要以头晕乏力，四肢酸软，畏寒腰酸为主，若不及时治疗可继发严重感染并出现并发症等。因此调节机体抗病能力，特别是抵抗癌治疗后引起的白细胞减少，减少感染的发生率，成为提高抗癌治疗质量的关键性因素。目前，临床上治疗白细胞减少症的药物以维生素类，嘌呤核苷酸类及辅酶类和集落刺激因子治疗为主。上述药物不同程度的存在着疗效不甚理想，价格昂贵，病人难以接受等弊端。因此开发有确切疗效的，价格低廉，且无毒副作用的升高白细胞的药物仍是临床上的迫切需要。褐藻胶是一类具有广泛生物活性的物质，我们在前期的研究中发现，甘露糖醛酸的酶解产物能对抗γ射线引起的小鼠白细胞数量的下降，促进小鼠造血系统的恢复。基上以上原因，本课题筛选了不同分子量的低聚甘露糖醛酸和低聚古罗糖醛酸在升高白细胞方面的活性，确定了升高白细胞作用的最佳有片段为分子量为5800的低聚甘露糖醛酸（以下简称M5800）。进一步以M5800为研究对象，研究其升高的白细胞的作用及机理。本论文主要开展了以下的研究工作：1.首先研究了不同分子量的低聚甘露糖醛酸和低聚古罗糖醛酸的理化性质：以M5800为例：利用硫酸‐咔唑法测定了M5800的糖醛酸含量为50.6%；利用HPGPC法测定了其重均分子量及分布系数分别为5.812KDa和1.080；测量了其比旋光度为‐69.16°，pH值为6.51。2.以环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制模型为药效筛选平台，分别研究了不同分子量的低聚甘露糖醛酸和低聚古罗糖醛酸对小鼠外周血白细胞的影响，并测定了小鼠血清中GM‐CSF的水平。结果表明，除分子量为2000的低聚古罗糖醛酸外，其余5个受试药均可不同程度地升高小鼠白细胞数量，同时可不同程度地升高小鼠血清中GM‐CSF水平，其中以分子量为5800的低聚甘露糖醛酸的作用最为明显。综合以上二个指标，分子量为5800的低聚甘露糖醛酸活性最强。以环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制模型为药效筛选平台，以白细胞和骨髓有核细胞数为观察指标，进一步研究了M5800的升白作用。结果表明，M5800在180mg/kg至540mg/kg范围内，均可明显升高小鼠白细胞数量和骨髓有核细胞数量，与模型组比较有明显差异。3.在细胞水平上研究了M5800升高白细胞的作用机理：（1）利用造血祖细胞体外琼脂培养法，通过体内给药和体外给药二种不同的给药途径，观察M5800对正常小鼠和模型小鼠粒-巨噬系造血祖细胞集落（CFU-GM）增殖分化的影响；采用造血因子生物活性检测法，研究经M5800诱导制备的骨髓基质细胞、脾细胞和胸腺细胞的培养上清液对小鼠CFU-GM增殖分化的影响。结果表明，①M5800能明显促进正常小鼠CFU‐GM集落的形成，与空白组比较，有显著性差异。并且在3.125μg/mL到25μg/mL范围内，随着药物浓度的加大，作用也逐渐增强，在25μg/mL时作用达到最大。②M5800体内给药，180mg/kg、360mg/kg和540mg/kg三个剂量组均能明显促进环磷酰胺模型小鼠CFU-GM的数量，与模型组比较，有极显著性差异。③经M5800诱导的骨髓基质细胞培养上清液，可明显促进CFU-GM的形成，在6.25μg/mL到50μg/mL范围内，与对照组比较，有明显差异。经M5800诱导的脾细胞和胸腺细胞培养上清液，也能明显促进CFU-GM的形成，与对照组比较，有明显差异。表明经M5800诱导的细胞培养上清液中粒-巨噬系集落刺激因子（GM-CSF）的含量或活性增加。（2）利用MTT法，检测了M5800对正常小鼠和环磷酰胺抑制模型小鼠骨髓基质细胞增殖能力的影响。结果显示，①M5800在6.25μg/mL到50μg/mL浓度范围内，能明显促进正常小鼠骨髓基质细胞的增殖，并且在25μg/mL时作用达到最强。②M5800对环磷酰胺抑制小鼠骨髓基质细胞的增殖有一定促进作用，其中50μg/mL组，与空白组比较，有显著性差异。（3）利用ELISA法研究M5800对骨髓基质细胞分泌GM‐CSF和干细胞因子（SCF）的影响，利用MTT法研究M5800对脾淋巴细胞分泌白介素‐3（IL‐3）的影响。结果表明，①M5800在12.5μg/mL至50μg/mL浓度范围内，能明显促进骨髓基质细胞分泌GM-CSF，与空白组比较有明显差异。②M5800在6.25μg/mL和50μg/mL范围内，能明显促进骨髓基质细胞分泌SCF，与空白组比较有显著性差异。③M5800能明显提高脾淋巴细胞产生IL-3的能力，与空白组比较，有显著性差异。（4）将M5800与异硫氰酸荧光素（FITC）进行反应，对其还原性末端进行荧光标记。培养骨髓基质细胞，将荧光标记物与骨髓基质细胞共同孵育，利用激光共聚焦扫描显微镜观察荧光标记药物在细胞中的定位情况。结果表明，M5800可作用于骨髓基质细胞，并在胞浆中发挥作用。

低聚甘露糖醛酸升高白细胞作用及机理研究

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