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白细胞介素24的生物制备、纯化及初步药效学分析

作　者: 于明磊
导　师: 张家骊
学　校: 江南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 白细胞介素24 表达 纯化 活性评价
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


白细胞介素24（IL-24）自20世纪90年代中期被发现以来，因其在抗肿瘤方面所表现出的特性，引起国内外众多学者的关注。本文将已构建的含有目的基因IL-24的表达质粒pET21a(+)/IL-24，导入大肠杆菌BL21构建工程菌，并使用大肠杆菌原核表达系统对IL-24进行发酵表达，建立了一套IL-24相关的高密度发酵、产物纯化工艺和复性工艺方法。工程菌经5L发酵罐30℃、1mmol/L IPTG诱导发酵10h，获得菌体湿重186.32g，单位体积目的蛋白的表达量达到1800mg/L。发酵结束后，菌体经离心、高压破碎获得IL-24包涵体蛋白，包涵体蛋白经洗涤、Q sepharose和SP sepharose离子交换层析，可得到纯度大于95%的IL-24蛋白，纯化总回收率约为20%。SDS-PAGE检测其分子量约为18.5kD，Western blot杂交以兔抗人IL-24单克隆抗体作为一抗，以HRP酶标抗体（羊抗兔）作为二抗，以DAB为底物进行显色反应，结果显示所获得的目的蛋白为IL-24。将纯化后的IL-24变性溶解，并通过原复性方案（苏州大学提供的复性方案）、梯度复性方案、2DR法复性方案等进行复性，采用B16细胞作为活性检测细胞株对复性后的IL-24蛋白进行活性测定，各复性方案的半数抑制浓度分别为3.67μmol/L、2.03μmol/L、2.56μmol/L，结果显示最佳复性方案为梯度复性方案。同时，对梯度复性所得的IL-24做进一步的肿瘤细胞生长抑制实验和诱导肿瘤细胞凋亡的实验，MTT法检测IL-24对肿瘤细胞的生长抑制，其中当IL-24浓度为90μg/mL时，IL-24对B16细胞的生长抑制率达76%，流式细胞仪检测B16的凋亡情况，凋亡率为45.3%，与对照组差异具有统计学意义(P=0.0018<0.01)。此外在进行IL-24体外活性评价过程中还发现B16细胞为IL-24的敏感细胞株，为以后IL-24活性评价细胞株的选择，提供了参考。

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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