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生物样品中蓖麻毒素检测方法的建立及蓖麻毒素在动物体内的分布与代谢研究

作　者: 王晨宇
导　师: 王玉霞
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 蓖麻毒素胶体金试纸双夹心ELISA法免疫组化代谢分布
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

蓖麻毒素(Ricin)是从蓖麻种子中提取的一种核糖体失活蛋白,分子量约为66 KD,由A、B两个亚基组成,两亚基通过二硫键相连。蓖麻毒素性质稳定、毒性极强、制备容易、施毒简单、无特效药,这些特性使其成为最具威胁的潜在生化战剂和最易于发动恐怖袭击的生物毒素[1]。半个世纪以来,蓖麻毒素在多个国家的恐怖事件中扮演主角,由于其特性为恐怖分子青睐,对全球公共安全构成显著威胁。近年来,为了应对蓖麻毒素的潜在威胁,括美、德、法、俄在内的多个国家对蓖麻毒素的防控和治疗投入了大量的财力和人力,随着学技术的进步,蓖麻毒素的检测方法逐渐增多,检测灵敏度也逐步提高,在公共安全事件的应对和处置中发挥了有效作用[2]。尽管如此,由于多数分析方法受到检测设备昂贵、检测周期长或实验操作要求严格等各种因素的限制,时至今日应对蓖麻毒素导致的突发事件和恐怖袭击的现场检测措施仍有待进一步完善。为了适应蓖麻毒素现场分析,尤其是对医学样品检测的需要,本课题应用蓖麻毒素中毒动物模型,建立了简便、精确的蓖麻毒素生物样品检测方法,并对不同染毒方式动物体内毒素的分布与代谢进行了初步的探索,同时通过免疫组化验证所建立的蓖麻毒素检测法的可靠性。实验方法:应用蓖麻毒素胶体金快速检测试纸对蓖麻毒素中毒动物的血清及组织样品进行测定;利用蓖麻毒素特异性单克隆抗体3D74与4C13建立蓖麻毒素的双夹心ELISA法并验证其实用性;比较PBS与动物组织样品中蓖麻毒素双夹心ELISA检测结果,优化检测方法并进行方法学验证;分别建立蓖麻毒素静脉染毒、肌注染毒、灌胃染毒动物模型,双夹心ELISA法定量分析中毒动物血清及组织样品中的毒素,分析不同染毒方式动物组织体内毒素的代谢与分布规律;通过免疫组化分析染毒动物的组织切片,同时验证ELISA法检测中毒动物样品中蓖麻毒素代谢和分布的可行性。实验结果:①在使用胶体金试纸检测蓖麻毒素中毒动物血清的实验中,由于血清成分对检测试纸有一定干扰,且由于试纸条自身检测限的限制,我们认为胶体金试纸可用于生物样品中较高浓度蓖麻毒素的定性检测。②应用单克隆抗体3D74与辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体4C13在PBS体系中建立的蓖麻毒素的双夹心ELISA方法,检测灵敏度可达2.5 ng/ml;应用此方法检测各动物组织稀释的蓖麻毒素标准品结果显示,与PBS稀释的相同浓度蓖麻毒素标准品相比,组织样品中的阳性信号明显减弱,组织样品的复杂成分影响抗原抗体的结合是导致该现象的主要原因,不同组织样品对检测信号的影响各不相同,为了校正组织样品对本方法的影响,应用正常组织溶液制备毒素标准曲线,以计算样品中真实的蓖麻毒素浓度;通过方法学指标测定,确定在生物样品的蓖麻毒素含量检测中,双夹心ELISA法具有良好的再现性和稳定性。③使用建立的双夹心ELISA法对不同中毒方式染毒(静脉注射、肌肉注射、灌胃)动物的生物样品进行检测。静脉注射染毒的情况下,毒素通过血液输送到心、肝、脾、肺、肾、肠等组织,血流丰富的脾脏和肝脏中蓖麻毒素的含量明显高于其他组织,而脑和肌肉中未能检出毒素;肌肉注射染毒动物血清和各组织样品的检测结果表明,毒素在较长的时间内驻留于注射部位,相对于静脉注射和灌胃毒素向其他组织的分布较慢,在注射部位肌肉中,毒素随时间推移呈逐步降低的趋势,而在血清和脾脏组织中,随着毒素在动物体内的逐步分布,呈现出先上升后下降的趋势,且在肝、肾、肺和肠组织中均能检出蓖麻毒素,对心、睾丸和胸腺样品的检测结果呈阴性;灌胃中毒大鼠的组织检测结果表明,肠内检出较高的蓖麻毒素含量,且随时间推移逐渐下降,而血清与其他组织样品中除肾脏外均无蓖麻毒素检出。④动物组织切片的免疫组化结果与双夹心ELISA法的检测结果基本保持一致。在静脉染毒小鼠的各组织中,心、肝、脾、肾和肺均检出阳性信号,信号强度与中毒剂量呈正相关趋势,而脑和肌肉组织均为阴性结果;对肌肉注射大鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠和肌肉组织切片的免疫组化均显示阳性信号,信号强度随时间表现为不同趋势,其中肺、肾和脾的阳性信号有所增加,而心、肝、肠和肌肉中的阳性信号则随时间逐渐减弱,胸腺和睾丸的检测结果均为阴性。上述实验结果说明,胶体金免疫层析试纸更适合对环境样品的检测分析,由于生物(医学)样品对试纸条的干扰作用,胶体金试纸虽可用于生物(医学)样品的定性检测,但有其局限性。而基于蓖麻毒素特异性单克隆抗体建立的双夹心ELISA法稳定可靠、重复性高,在实际检测中兼顾了检测效率与准确度,为蓖麻毒素的快速侦检提供了便捷的方法,为深入研究毒素的体内代谢规律提供了有效的分析手段,为认识染毒途径、剂量与体内暴露的相关性以及寻找合理的抗毒治疗时机提供了科学依据。

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-11
1 前言  11-17
  1.1 蓖麻毒素简介  11
  1.2 毒素的结构及作用机制  11-13
  1.3 蓖麻毒素的威胁  13
  1.4 蓖麻毒素的毒性和救治  13-14
  1.5 蓖麻毒素的检测方法  14-16
  1.6 我们的研究方案  16-17
2 胶体金试纸检测中毒动物血清样品中的蓖麻毒素  17-23
  2.1 材料与试剂  18
  2.2 实验方法  18-19
    2.2.1 蓖麻毒素检测试纸检测灵敏度的测定  18
    2.2.2 胶体金检测试纸对小鼠血清样品的检测  18
    2.2.3 胶体金检测试纸对大鼠血清样品的检测  18
    2.2.4 胶体金检测试纸对人血清样品的检测  18
    2.2.5 蓖麻毒素在人血清内的稳定性分析  18-19
  2.3 实验结果  19-21
    2.3.1 蓖麻毒素检测试纸检测灵敏度的测定  19
    2.3.2 胶体金检测试纸对小鼠血清样品的检测  19-20
    2.3.3 胶体金检测试纸对大鼠血清样品的检测  20
    2.3.4 胶体金检测试纸对人血清样品的检测  20-21
    2.3.5 蓖麻毒素在人血清内的稳定性分析  21
  2.4 讨论  21-23
3 生物样品中蓖麻毒素检测方法（ELISA）的建立  23-30
  3.1 实验材料  23-24
    3.1.1 试剂与材料  23
    3.1.2 主要实验仪器  23
    3.1.3 缓冲液配制方法  23-24
  3.2 实验方法  24-25
    3.2.1 蓖麻毒素的双夹心ELISA 检测法  24
    3.2.2 蓖麻毒素双夹心ELISA 检测法的精密度实验  24-25
    3.2.3 动物组织样品对蓖麻毒素双夹心ELISA 检测法的干扰  25
    3.2.4 蓖麻毒素双夹心ELISA 法用于生物样品检测的精密度实验  25
  3.3 实验结果  25-28
    3.3.1 PBS 体系下蓖麻毒素双夹心ELISA 检测法的标准曲线  25-27
    3.3.2 蓖麻毒素的双夹心ELISA 检测法的精密度实验  27
    3.3.3 不同组织样品对蓖麻毒素的双夹心ELISA 检测法的干扰  27-28
    3.3.4 蓖麻毒素双夹心ELISA 法检测生物样品的方法学验证  28
  3.4 讨论  28-30
4 双夹心ELISA 法检测生物样品中蓖麻毒素的应用  30-40
  4.1 实验材料  30-31
    4.1.1 试剂与材料  30
    4.1.2 主要实验仪器  30
    4.1.3 缓冲液配制方法  30-31
  4.2 实验方法  31-32
    4.2.1 尾静脉注射蓖麻毒素中毒大鼠各组织样品的检测  31
    4.2.2 尾静脉注射蓖麻毒素中毒大鼠血浆的代谢动力学测定  31-32
    4.2.3 肌肉注射蓖麻毒素中毒大鼠各组织样品的毒素检测  32
    4.2.4 蓖麻毒素灌胃中毒大鼠各组织样品的初步分析  32
  4.3 实验结果  32-38
    4.3.1 尾静脉注射蓖麻毒素中毒大鼠各组织样品的检测结果  32-34
    4.3.2 静脉注射蓖麻毒素中毒大鼠血清的代谢动力学分析  34-35
    4.3.3 肌肉注射蓖麻毒素中毒大鼠各组织样品的检测结果  35-38
    4.3.4 蓖麻毒素灌胃中毒大鼠各组织样品的检测结果  38
  4.4 讨论  38-40
5 蓖麻毒素中毒动物组织的免疫组化及HE 染色分析  40-51
  5.1 实验材料  40-41
    5.1.1 试剂与材料  40
    5.1.2 主要实验仪器  40
    5.1.3 缓冲液配置方法  40-41
  5.2 实验方法  41-42
    5.2.1 动物攻毒方法  41
    5.2.2 静脉注射中毒小鼠各组织切片的免疫组化  41-42
    5.2.3 肌肉注射蓖麻毒素中毒大鼠组织的免疫组化  42
    5.2.4 静脉注射蓖麻毒素中毒小鼠组织的HE 染色  42
    5.2.5 肌肉注射蓖麻毒素中毒大鼠组织的HE 染色  42
  5.3 实验结果  42-49
    5.3.1 尾静脉注射蓖麻毒素各剂量组小鼠的死亡时间  42-43
    5.3.2 尾静脉注射蓖麻毒素中毒小鼠各组织的免疫组化分析  43-45
    5.3.3 肌肉注射蓖麻毒素中毒大鼠各组织的免疫组化分析  45-47
    5.3.4 尾静脉注射蓖麻毒素中毒小鼠各组织的HE 染色结果  47-48
    5.3.5 肌肉注射蓖麻毒素中毒大鼠各组织的HE 染色结果  48-49
  5.4 讨论  49-51
6 总结  51-53
参考文献  53-56
附录一：文献综述  56-62
附录二：在学期间撰写的文章  62-70
附录三：个人简历  70-71
致谢  71

生物样品中蓖麻毒素检测方法的建立及蓖麻毒素在动物体内的分布与代谢研究

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