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肝细胞生长因子的克隆、表达以及体内外的应用

作　者: 常志静
导　师: 周立军
学　校: 天津大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 肝细胞生长因子转染成纤维细胞动物模型
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：本研究建立了一种非病毒型人肝细胞生长因子（Human hepatocytegrowth factor, HGF）的基因治疗方式，避免病毒载体基因治疗所导致的副作用[1]。通过定性及定量检测体外培养的人成纤维细胞中HGF的表达及其体内应用，为HGF治疗脱发、促进毛发再生的临床应用提供一个前景良好的实验依据。方法：克隆人的hHGF全长cDNA片段，插入pTARGET真核表达载体中，得到pTARGET-HGF质粒。采用脂质体lipofectamin2000包裹重组质粒将其转染到体外培养的人的皮肤成纤维细胞中（Human skin fibroblasts,HSF）。由于本研究室之前已经构建成功的pEGFP-N1-HGF含有报告基因绿色荧光蛋白（GFP），在荧光显微镜下观察转染率具有直观性，所以在探索最佳细胞接种密度、DNA浓度和脂质体浓度等因素时，用pEGFP-N1-HGF得到的最佳转染率作为参考。采用蛋白质印记方法（western blot）、酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA）分别进行HGF蛋白表达的定性定量检测后，将其通过皮下注射应用于小鼠体内，通过HE染色、免疫组化（Immunofluorescence staining）检测HGF在小鼠皮肤内的表达。结果：1.质粒构建成功后，双酶切结果：经去内毒素提取纯化质粒后，BamHI、SalI进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后，可得到5.67kb和2.2kb两个片段，与pTARGET质粒的图谱相符，证明所得到的质粒为重组子pTARGET-HGF。2.经传代培养的成纤维细胞在达到对数期的良好生长状态，既80%的细胞达到融合后，转染目的质粒pTARGET-HGF、pEGFP-N1-HGF，在荧光显微镜下观测到经pEGFP-N1-HGF质粒转染后的细胞发出绿色荧光，得到细胞接种密度为3.0×105，DNA浓度为0.8μg，脂质体用量为4.5μL时获得最高转染率，分别为57.35±1.29%、52.47±1.26%和57.73±1.31%。3.体外转染细胞后，采用western blot证明重组的pTARGET-HGF基因在成纤维细胞中有所表达，同时提取转染后的细胞上清液，经ELISA鉴定后检测到hHGF在转染到人的皮肤成纤维细胞后可以分泌出hHGF，其分泌量达到（5.76~10.74ng/9×105cells）。将其用于体内后，发现实验组与对照组相比，毛囊生长明显浓密，且经免疫组化检测到HGF在皮肤中的表达。结论：成功构建含有HGF基因的真核载体pTARGET-HGF，并将其应用于体外试验中，检测到其表达及分泌后，再将其用于体内，发现小鼠的毛囊发育有明显的改善。由此可证明HGF具有生发的作用。

全文目录

中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
第一章绪论  9-21
  1.1 前言  9-10
  1.2 肝细胞生长因子的产生  10-11
    1.2.1 肝细胞生长因子产生的部位  10
    1.2.2 HGF 产生的调节  10-11
  1.3 HGF 及其受体 c-met 的结构  11-12
  1.4 毛囊生长周期与毛乳头  12-14
    1.4.1 毛囊  12
    1.4.2 毛乳头  12-14
      1.4.2.1 毛乳头细胞的特征  12-13
      1.4.2.2 毛乳头细胞诱导毛发生长  13-14
  1.5 HGF/c-met 系统的生理功能及作用机制  14-16
    1.5.1 HGF 在毛囊中的表达与分布  15
    1.5.2 HGF 调节毛囊毛发生长的可能机制  15-16
  1.6 基因治疗  16-18
  1.7 成纤维细胞作为体外基因转染模型  18
  1.8 β-catenin 与毛囊发育  18-19
  1.9 本课题中质粒构建的流程图及研究方法  19-21
第二章材料与方法  21-39
  2.1 实验材料  21-26
    2.1.1 实验动物  21
    2.1.2 仪器与设备  21-22
    2.1.3 工具酶及试剂盒  22
    2.1.4 菌株  22
    2.1.5 质粒  22-23
    2.1.6 细胞系  23
    2.1.7 常用试剂  23-24
    2.1.8 溶液配制  24-26
  2.2 方法  26-35
    2.2.1 HGF 全长基因的克隆  26-28
      2.2.1.1 PCR 方法扩增出 HGF cDNA  26-27
      2.2.1.2 扩增产物检测  27-28
      2.2.1.3 PCR 产物回收及纯化  28
    2.2.2 真核表达载体 pTARGET-HGF 的构建  28-29
    2.2.3 重组质粒体外转染人的皮肤成纤维细胞  29-30
      2.2.3.1 皮肤成纤维细胞的培养  29
      2.2.3.2 人皮肤成纤维细胞的冻存  29-30
    2.2.4 人皮肤成纤维细胞的复苏  30
    2.2.5 无内毒素真核载体 pTARGET-HGF 的提取及纯化  30-32
    2.2.6 无内毒素重组真核质粒转染皮肤成纤维细胞  32
    2.2.7 转染基因表达的测定  32-35
      2.2.7.1 蛋白质免疫印迹  32-33
      2.2.7.2 人成纤维细胞分泌 HGF 的检测  33-35
  2.3 体内应用重组质粒实验  35-39
    2.3.1 实验分组  35
    2.3.2 小鼠背部脱毛  35-36
    2.3.3 体内给药  36
    2.3.4 转染复合物的配制  36
    2.3.5 皮下注射给药  36
    2.3.6 切片染色观察毛囊的形态  36-37
    2.3.7 免疫组化检测 c-met 和β-catenin 在体内的表达  37-39
第三章结果与讨论  39-55
  3.1 HGF cDNA 的克隆  39-40
  3.2 真核重组表达载体的构建  40-42
  3.3 重组真核载体转染体外培养的皮肤成纤维细胞  42-47
    3.3.1 人皮肤成纤维细胞的培养  42-43
    3.3.2 重组真核载体体外转染人的皮肤成纤维细胞  43-47
      3.3.2.1 转染条件的优化  43-47
  3.4 皮肤成纤维细胞中 HGF 表达的测定  47-50
    3.4.1 Western blot 鉴定 HGF 在细胞内的表达  47-49
    3.4.2 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay）  49-50
  3.5 重组质粒在体内实验中 HGF 表达的检测  50-55
    3.5.1 各实验组及对照组小鼠的毛发生长状况  50-52
    3.5.2 HE 染色观察毛囊发育情况  52-54
    3.5.4 免疫组化检测 c-met 在毛囊中的表达  54
    3.5.5 免疫组化检测 β-catenin 在毛囊中的表达  54-55
第四章结论与展望  55-57
  4.1 结论  55-56
  4.2 展望  56-57
参考文献  57-61
发表论文和参加科研情况说明  61-62
致谢  62

肝细胞生长因子的克隆、表达以及体内外的应用

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