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血虚证模型与四物汤反证的代谢组学研究

作　者: 霍超
导　师: 高月; 颜贤忠; 马增春
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 代谢组学血虚证四物汤
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

代谢组学是利用各种谱学技术对生物体液、组织或细胞进行系统分析,对由外源性刺激、病理生理变化或者遗传变异等因素引起的内源性小分子代谢物谱随时间的变化进行检测、鉴定和定量,并利用模式识别方法对这种变化进行分类和预测,进而确定相关的生物标志物,对整体的生物学状况和功能作出评价的学科,以其高通量、整体性的研究特点为中医药现代研究提供了新的思路和手段。血虚证是中医临床常见证候,本课题组对血虚证的复杂病理机制已经做了大量的研究工作,前期分别在外周血象、骨髓造血干祖细胞、CD34+细胞表达、细胞周期与凋亡、造血和免疫相关基因蛋白的表达方面考查了其病理机制;四物汤是治疗血虚证的首选药,前期的工作基础验证了其在促进骨髓造血细胞集落形成,升高外周血成分等方面的药理作用。为了在整体水平从生化代谢的分子层面进一步揭示血虚证病理实质和四物汤的药理作用,本课题应用核磁共振(NMR)及超高效液相色谱质谱联用(UPLC-MS)两种代谢组学平台,对由不同的造模方法所致的血虚证小鼠模型的血清、脾脏、胸腺、骨髓进行代谢物的检测与分析,得到了相关的生物标志物,通过生物标志物的生理功能和代谢通路的分析,对血虚证的病理实质和四物汤的药理作用作进一步探讨。第一部分内容是基于NMR技术的综合放血法所致血虚证小鼠模型的代谢组学研究。方法是选用C57小鼠30只,按体重随机分为3组:正常对照组、模型组及四物汤反证组。造模10天后对小鼠进行股动脉取血,处死之后取脾脏、胸腺和骨髓,提取血清及组织的水溶性和脂溶性代谢物,用600MHz傅里叶变换核磁共振(NMR)波谱仪检测,对所得的一维氢谱进行分段积分并进行归一化处理,用SIMCA-P10.0软件进行模式识别分析。研究结果发现小鼠血清代谢物的变化情况是:与正常组相比,模型组中乳酸、胆碱含量下降,羟基丁酸含量上升;骨髓代谢物的变化情况为:与正常组相比,模型组中牛磺酸、胆碱含量上升,乳酸、肌酐与低密度脂蛋白含量下降;脾脏代谢物的变化情况为:与正常组相比,模型组中乙酰乙酸盐、不饱和脂肪酸含量上升,乳酸、低密度脂蛋白含量下降;胸腺代谢物的变化情况为:与正常组相比,模型组中肌酐、葡萄糖、低密度脂蛋白含量上升,乳酸、牛磺酸、谷氨酰胺含量下降,这些代谢物的变化提示着该血虚证模型小鼠机体的糖有氧氧化受到抑制,无氧酵解减弱,脂肪动员加强,淋巴细胞增殖受到抑制及机体免疫功能受损。与前期辐射损伤及化学损伤造模法进行生物标志物的比较,可以发现三种造模方法都可以导致机体糖类代谢和脂类代谢紊乱以及免疫功能受损,辐射造模和环磷酰胺造模还可导致细胞膜损伤,细胞内外渗透压平衡破坏。在四物汤反证组中上述标志物的含量都有不同程度的回调,验证了四物汤是治疗血虚证的良方。为了得到更加全面的代谢网络,我们把UPLC-ESI-Q-TOF/MS技术引入到这部分系统研究工作中,通过对样品预处理、色谱条件、质谱条件及数据统计方法的优化,建立了基于UPLC-ESI-Q-TOF/MS技术的代谢组学平台,并成功地把该平台应用于辐射损伤所致血虚证的研究。实验方法为:选用C57小鼠36只,按体重随机分为3组:正常对照组、模型组及四物汤反证组。造模方法是采用60Coγ射线全身1次性照射,照射剂量3.5 Gy,造模7天后股动脉取血、处死后取脾脏和胸腺,进行一系列预处理后用UPLC-ESI-Q-TOF/MS检测,应用MarkerLynx XS专用软件可以对检测所得的总离子流图进行色谱峰识别、峰匹配,对峰面积积分,将每一个数据点转换成精确质量和保留时间(EMRT)数据对,并以二维矩阵的形式将结果列出,利用主成分分析法对数据进行处理,之后采用正交偏最小二乘法进行组间数据分析(OPLS-DA)。通过模式识别分析,快速确认标志物,结果发现了溶血磷脂、葡糖苷酸、单酰甘油酯、三羟基丁酸、神经酰胺、天冬氨酸、肉毒碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺等生物标志物。通过对这些生物标志物的生理功能分析,推测辐射损伤使小鼠机体的脂类代谢、糖类代谢及部分氨基酸的合成代谢发生紊乱。在第三部分中,结合NMR及UPLC-MS两种代谢组学平台的操作方法及检测结果,我们对这两种平台的特点及各自的优劣性进行比较及评析。结果表明结合多种技术平台的代谢组学研究结果,可以得到更加全面的代谢网络,对病理生理过程有更加深入的认识。本课题结合了NMR及UPLC-MS这两种应用最广泛的,检测范围最广的技术平台,尤其在UPLC-MS平台中应用了反相C18柱和HILIC柱两种色谱柱,进一步拓展了代谢物的检测范围,得到了血虚证模型小鼠的大量的生物标志物,在生化代谢的分子层面对血虚证的病理生理过程有进一步的认识。

全文目录

英文缩略图表  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-16
第一部分：综合放血法所致血虚证及四物汤反证的代谢组学研究（基于NMR 平台）  16-36
  1 仪器与试剂  16
  2 材料与方法  16-18
  3 实验结果  18-31
  4 讨论  31-36
第二部分：辐射损伤所致血虚证及四物汤反证的代谢组学研究（基于UPLC-ESI-Q-TOF/MS 平台）  36-86
  1 基于UPLC-ESI-Q-TOF/MS 技术的代谢组学平台的建立  36-42
  2 辐射损伤所致血虚证及四物汤反证的代谢组学研究（基于UPLC-ESI-Q-TOF/MS 平台）  42-86
    2.1 仪器与试剂  42
    2.2 材料与方法  42-43
    2.3 实验结果  43-84
    2.4 结果讨论  84-86
第三部分：NMR 与UPLC-MS 两种平台的对比与评析  86-88
结论  88
参考文献  88-93
综述  93-102
  参考文献  100-102
个人简历  102-103
致谢  103

血虚证模型与四物汤反证的代谢组学研究

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