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氯霉胺衍生物类氨肽酶N抑制剂的合理设计、合成及初步活性研究

作　者: 贾美荣
导　师: 徐文方
学　校: 山东大学
专　业: 药物化学
关键词: 氨肽酶N 氯霉胺衍生物 化学合成 活性测试 定量构效关系
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


氨肽酶N(Aminopeptidase N, APN/CD13)是MA宗族,Ml家族中的一种锌离子依赖性的跨膜金属蛋白酶。氨肽酶N包括N-末端胞内区、跨膜区、C-末端胞外活性催化作用区三部分,生理状态下以二聚体的形式结合在细胞表面。APN广泛分布在人体肾、肠及中枢神经系统的多种细胞表面,尤其选择性的高表达于多种肿瘤细胞表面,如人髓性白血病细胞HL-60、人卵巢癌细胞ES-2。APN具有较强的蛋白酶水解功能,其对细胞外基质(ECM)的降解决定了APN在恶性肿瘤的发生发展中有着重要的作用,例如,APN可促进肿瘤细胞的侵袭转移、促进肿瘤新生血管的生成、促进肿瘤细胞的增殖分化等。因此,APN已成为当下开发抗肿瘤药物及抗血管生成药物的重要靶点。APN抑制剂的开发是研究抗APN药物的重要途径。1987年在日本上市的首个APN抑制剂药物Bestatin,至今仍用于急性白血病的治疗。其它APN天然抑制剂,包括Probestatin、Amastatin等亦相继被发现；同时,化学合成类APN抑制剂,包括β-氨基硫醇类、α-氨基磷酸类等相继被合成。经数年研究,本课题组亦报道了多类骨架的小分子类肽类APN抑制剂。鉴于人源APN与大肠杆菌APN (eAPN)活性位点序列的高度同源性,我们以eAPN晶体结构及其与Bestatin作用模式为理论基础,结合本实验室前期工作,借助计算机辅助药物设计(CADD)筛选获得了以(1S,2S)-2,3-二氨基-1-(4-硝基苯基)丙烷-1-醇(DANP)为母核的可与APN较好结合的小分子类肽化合物。本课题以(1S,2S)-2-氨基-1-(4-硝基苯基)-1,3-丙二醇(ANP)为起始原料,经Boc-保护反应、溴取代反应、叠氮化反应及还原反应或采用一锅法直接获得关键中间体：Boc保护的(1S,2S)-2,3-二氨基-1-(4-硝基苯基)丙烷-1-醇(DANP),而后通过肽缩合反应,得到系列类肽产物。同时,本研究考察了强吸电性的硝基对活性的影响。关键中间体及目标化合物通过核磁共振氢谱、电喷雾质谱、高分辨质谱等结构确证。本课题对目标化合物进行了体外初步生物活性评价,包括抑酶活性测试、抑制肿瘤细胞生长测试、抗肿瘤细胞侵袭测试、抗血管生成测试等。本课题共获得30个小分子类肽化合物。体外抑酶活性实验表明大部分产物具有一定的APN抑制活性,其中化合物9l、9r、10e的IC50在10μM以下,接近于阳性对照Bestatin(IC50=3.7±0.4μM)。其中类三肽化合物的活性大多优于类二肽化合物,可能由于多出的疏水侧链加强了化合物与APN疏水口袋的结合。氨基取代或卤素取代对此系列化合物活性的影响不大,说明电性效应对目标产物的活性影响较小。抗肿瘤细胞侵袭实验表明,化合物9c、9r、10e能显著抑制ES-2细胞对基底膜的侵袭。大鼠主动脉环微血管生成实验证明了化合物9l、10e有效的体外抗血管生成的作用。最后,结合活性结果,我们对化合物作了定量构效关系研究。以化合物10e为例研究了此类化合物与APN作用机制。采用比较分子力场分析方法(CoMFA)成功构建了此类化合物的3D-QSAR模型。本研究利用CADD设计并合成的氯霉胺衍生物具有较好的APN抑制活性,起始原料经济易得,合成路线科学合理,经初步活性测试筛选出具有后续研究价值的化合物,并合理构建了3D-QSAR模型,为类似结构化合物的研究奠定了基础。

全文目录


摘要  10-12
ABSTRACT  12-14
符号说明  14-16
第一章 前言  16-30
  1.1 氨肽酶N  16-22
    1.1.1 氨肽酶N的生理结构  16-18
    1.1.2 氨肽酶N的组织分布  18
    1.1.3 氨肽酶N的生理功能  18-22
      1.1.3.1 氨肽酶N与肿瘤的发生和发展  18-20
      1.1.3.2 氨肽酶N与免疫调节  20
      1.1.3.3 氨肽酶N与疼痛调节  20-21
      1.1.3.4 氨肽酶N的其它功能  21-22
  1.2 氨肽酶N抑制剂研究进展  22-30
    1.2.1 天然产物类氨肽酶N抑制剂  22-25
    1.2.2 化学合成类氨肽酶N抑制剂  25-30
第二章 氨肽酶N抑制剂的合理药物设计  30-37
  2.1 类肽概念及设计策略  30
  2.2 氨肽酶N的活性位点及抑制剂的共性结构特征  30-32
    2.2.1 氨肽酶N的活性位点  30-31
    2.2.2 氨肽酶N抑制剂的共性结构特征  31-32
  2.3 基于氨肽酶N及天然配体结构的合理药物设计  32-37
    2.3.1 计算机辅助抑制剂母核的设计  32
    2.3.2 氯霉胺类衍生物的设计及优化  32-37
第三章 目标化合物的合成  37-53
  3.1 母核DANP的化学合成  37-40
  3.2 目标化合物9a-9r、10a-10g、11a-11e的合成  40-51
  3.3 实验讨论  51-53
第四章 目标化合物的初步生物活性评价  53-69
  4.1 体外抑酶活性评价  53-60
    4.1.1 目标化合物抑制氨肽酶N活性检测  53-54
    4.1.2 目标化合物抑制基质金属蛋白酶-2活性检测  54-56
    4.1.3 抑酶活性评价结果  56-60
  4.2 部分目标化合物抑制人肿瘤细胞表面APN活性检测  60-62
    4.2.1 实验原理  60
    4.2.2 材料与方法  60-61
    4.2.3 实验结果  61-62
  4.3 部分目标化合物抑制肿瘤细胞生长检测  62-64
    4.3.1 实验原理  62
    4.3.2 材料与方法  62-63
    4.3.3 实验结果  63-64
  4.4 部分目标化合物抗肿瘤细胞侵袭作用检测  64-67
    4.4.1 实验原理  64
    4.4.2 材料与方法  64-65
    4.4.3 实验结果  65-67
  4.5 部分目标化合物抑制新生血管生成作用检测  67-69
    4.5.1 实验原理  67
    4.5.2 材料与方法  67
    4.5.3 实验结果  67-69
第五章 目标化合物的构效关系研究  69-73
  5.1 氨肽酶N抑制剂的作用模式研究  69-70
    5.1.1 分子对接条件确立  69
    5.1.2 分子对接结果分析  69-70
  5.2 氨肽酶N抑制剂的定量构效关系研究  70-73
    5.2.1 比较分子场分析(CoMFA)  70-71
    5.2.2 CoMFA模型的建立及验证  71
    5.2.3 CoMFA模型的分析及应用  71-73
第六章 总结与展望  73-75
  6.1 总结  73-74
  6.2 展望  74-75
参考文献  75-81
致谢  81-82
攻读学位期间发表的学术论文目录  82-83
附录Ⅰ 部分化合物的ESI-MS、HRMS、1H-NMR图谱  83-106
附录Ⅱ 外文论文  106-107
学位论文评阅及答辩情况表  107

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