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抗乙肝病毒候选药MCC478新酯的早期毒性研究

作　者: 高羚喻
导　师: 廖明阳; 吴纯启; 王全军
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 卫生毒理学
关键词: 核苷酸类似物早期毒性筛选计算毒理学 MCC478新酯
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒（HBV）感染机体后所引起的疾病。它是一种严重危害人类健康的疾病，具有发病率高，人群分布广泛，难治愈易复发，易产生耐药性等特点。目前，乙型肝炎的主要治疗手段为药物治疗，已有的治疗药物包括天然多糖类活性物质、干扰素（IFN）α及核苷（酸）类似物（NUCs）三大类。其中应用最多的为核苷（酸）类似物（NUCs）。现有的抗乙肝病毒药核苷（酸）类似物有拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替诺福韦酯、克拉夫定等。拉米夫定需要长期给药，易产生耐药性；阿德福韦酯最常用的抗乙肝病毒药物，无需细胞内磷酸化，与拉米夫定没有交叉耐药性，而且自身不易产生耐药性；但是具有剂量限制性的肾脏毒性；替诺福韦酯是目前最有效的抗乙肝病毒药物，在我国有专利保护，尚未在中国上市；生物利用度低，剂量较大，成本较高。阿德福韦酯及替诺福韦酯均为活泼酯前药，进入体内迅速在血浆中水解，化学稳定性较差。阿米福韦酯（Alamifovir，MCC478）属于新化学结构类型的核苷酸类抗乙肝病毒新药，在化学结构上，与目前已知的核苷类抗乙肝药物不同，在核苷碱基母核的6位为苯硫基取代。在抗乙肝病毒方面，该化学物对HBV具有高度选择性的抑制作用，而对HIV、HSV等其它逆转录病毒没有作用，显示出独特的药理学性质；其次，它对抗拉米夫定的HBV耐药株（YMDD变异）有效。最后，对肝脏具有高度选择性的分布，能特异性直达靶器官，发挥药理学作用。目前MCC478已进入Ⅱ期临床。MCC478新酯为本所开发的MCC478类似物，其抗病毒活性是MCC478的100多倍。在药物代谢方面，MCC478新酯在体内不形成毒性代谢中间产物，而是完全水解为核苷酸形式，避免了代谢中间产物产生的毒性。另外，通过形成富马酸盐，提高了药物的稳定性和水溶性。MCC478新酯在药理、药代、药剂以及药效方面均优于MCC478，那么其毒性是否也低于MCC478？是否更安全？是否能满足毒理学的成药条件？此即本课题所需回答的问题。具体研究内容及结果如下：首先，采用Derek软件进行计算毒理学预测分析，结果发现在致癌性、抑制胆碱酯酶、神经毒性、急性中毒性肾病、皮肤致敏、白细胞和免疫累积毒性、染色体损伤毒性方面只在代谢中间体中预测可能发生，而MCC478，MCC478新酯则不表现出来；在肝毒性方面，MCC478，MCC478新酯在大鼠、犬、人类中都表现出来，而代谢中间体预测则提示没有肝毒性。其次，体外对MCC478新酯进行细胞毒性试验得到结果如下：MCC478新酯对HepG2细胞和HK-2细胞形态的影响，对照组细胞生长状态旺盛，伸展性良好，而给药组发生了不同程度的细胞皱缩，细胞空泡化，死细胞增多，而且呈现剂量效应关系。通过MTT试验测定MCC478新酯等对细胞增殖抑制的结果如下：MCC478新酯和MCC478能够明显抑制细胞的增殖，其IC50值分别为：MCC478新酯113.68μM，MCC478为638.20μM；MCC478的活性产物PMPA以及毒性代谢中间体单酯都能够抑制细胞的增殖，但抑制率未达到50%。因此，毒性大小顺序为MCC478新酯＞MCC478＞单酯＞PMPA。其三，利用Ames波动试验研究MCC478新酯的致突变性，结果如下：采用环磷酰胺和叠氮钠分别作为加S9与不加S9条件下的阳性对照物，结果与溶剂对照组相比均有显著性差异，证明本实验系统真实可信。在加与不加S9的情况下，MCC478及MCC478新酯阳性孔数与对照组相比均没有显著性差异，提示MCC478及MCC478新酯均对TA100菌株无致突变性。其四，利用上下法进行体内急性毒性研究，结果如下：阿德福韦酯经口染毒大鼠LD₅0=1296mg/kg（♀），95%CI（760²000mg/kg）；MCC478新酯经口染毒大鼠LD₅0>2000mg/kg（♀）；根据急性毒性分级标准，均属于低毒物质，且二者比较，MCC478新酯的LD50大于阿德福韦酯，说明MCC478新酯的急性毒性要低于阿德福韦酯。染毒后出现的毒性表现有：精神萎靡，竖毛；眼角分泌物，肛周污秽，腹泻，角弓反张。最后，选择大鼠灌胃MCC478新酯14天重复染毒毒性试验来观察MCC478新酯的重复给药毒性特点。动物随机分为溶剂对照组、MCC478新酯低剂量35mg/kg组、中剂量70mg/kg组、高剂量140mg/kg组和阳性对照阿德福韦100mg/kg组。结果发现：随着剂量升高，MCC478新酯动物的体重呈现逐渐下降趋势，但各剂量组与对照组相比没有显著性差异；从整个实验期间观察来看，低剂量组摄食量略高于对照组，中高剂量组摄食量与对照组相比则呈下降趋势，但均无统计学差异，总体看来，MCC478新酯对大鼠摄食量没有明显的影响。MCC478新酯低、中、高三个剂量组随着剂量升高，肝脏系数呈下降趋势，而阿德福韦酯阳性对照组的肝脏系数略高于溶剂对照组，但各给药组间与对照组均无显著性差异。MCC478新酯高剂量组以及阳性对照组的肾脏系数高于对照组，差异具有统计学意义。病理组织学检查结果：MCC478新酯低剂量35mg/kg组，中剂量70mg/kg组，高剂量140mg/kg组，均示肾脏结构正常；阿德福韦100mg/kg阳性对照组，示肾近曲小管上皮细胞有轻度损伤。低剂量组35mg/kg，中剂量组70mg/kg示肝细胞和肝组织结构正常；高剂量组140mg/kg示肝细胞肿胀等轻度损伤;阳性对照组阿德福韦100mg/kg示肝组织结构正常.低剂量组35mg/kg，中剂量组70mg/kg，高剂量组140mg/kg示小肠结构正常；阳性对照组阿德福韦100mg/kg示小肠粘膜层萎缩和小肠细胞损伤.淋巴组织在各剂量组结构均显示正常。综合以上研究结果，得出以下结论：1.虽然MCC478新酯急性毒性小，但高剂量组长期给药后显示一定的肝毒性；2.采用敏感特异的的生物标志物检测发现，MCC478新酯可能有一定的肾毒性；3.对照药Adefovir具有肾毒性，与国外文献报道一致，说明此试验系统可信；4.MCC478和MCC478新酯在有无S9活化条件下均无致突变性；5.体内外实验结果与毒性预测软件的预测结果有较好的一致性。6.MCC478新酯的毒性相当于或优于MCC478，基本满足毒理学的成药条件。

全文目录

缩略词对照表  4-5
摘要  5-8
ABSTRACT  8-11
前言  11-18
  参考文献  16-18
第一章 MCC478新酯的计算毒理学预测  18-22
  材料与方法  18-19
  结果  19-20
  讨论  20-21
  参考文献  21-22
第二章 MCC478新酯的早期毒性筛选  22-37
  第一节 MCC478新酯的基本细胞毒性  23-26
    材料与方法  23-24
    结果  24-26
  第二节 MCC478新酯的致突变性研究  26-32
    材料与方法  26-31
    结果  31-32
  第三节 MCC478新酯的急性毒性上下法研究  32-35
    材料与方法  32-34
    结果  34-35
  讨论  35-37
第三章 MCC478新酯的亚急性毒性研究  37-52
  材料与方法  38-41
  结果  41-50
  讨论  50-52
结论  52-53
致谢  53-54
综述  54-67
  参考文献  64-67
发表及撰写文章  67-73

抗乙肝病毒候选药MCC478新酯的早期毒性研究

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