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OEL和Fluopsin C的抗肿瘤活性及机制研究

作　者: 崔敏
导　师: 李霞; 娄红祥
学　校: 山东大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: OEL Fluopsin C 凋亡胀亡
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目前,恶性肿瘤已经成为严重危害人类健康的因素之一。恶性肿瘤的发病率呈现逐年上升的趋势,乳腺癌是最常见的恶性肿瘤,其发病机制复杂,尚无有效的治疗手段,它的预防与治疗一直备受关注,在临床上肿瘤耐药时有发生,使得寻找新型抗癌药物成为当务之急。本文主要阐述了两种化合物的抗肿瘤活性和初步探讨了它们的抗肿瘤作用机理,一种是来源于须弥紫苑的新型桉烷内酯类化合物1-氧-11(13)-烯-12,8a-桉烷内酯(OEL),另一种是最早从假单胞杆菌中发现的代谢产物,目前在我们实验室得到大量合成的抗生素铜硫甲酰素(Fluopsin C)。MTT法检测了OEL对肿瘤细胞株A172、MG-63、MCF-7、U87和KB的生长抑制作用,结果显示OEL可以有效抑制上述肿瘤细胞的生长,而OEL对正常细胞株EVC304和HL7702的细胞毒性与肿瘤细胞相比显著降低,表明肿瘤细胞对OEL更为敏感。我们筛选抑制增殖作用尤为显著的乳腺癌细胞株MCF-7进行作用机理的初步探讨,首先,生长抑制作用结果显示,药物抑制趋势呈明显的时间和剂量的依赖性增长,然后用倒置显微镜观察加药细胞的形态变化,DAPI染色后荧光显微镜观察细胞核的形态,Annexin V/PI双染法利用流式细胞仪检测凋亡坏死率,发现与对照组相比加入了OEL后的细胞皱缩、产生凋亡小体、凋亡率增加,这些结果暗示我们,OEL可以通过细胞凋亡的方式诱导乳腺癌细胞MCF-7死亡。在OEL诱导MCF-7细胞凋亡的信号转导途径中,我们发现细胞内的活性氧ROS、线粒体、多种蛋白酶及激酶参与了细胞的调控。OEL作用于MCF-7细胞后,ROS的产生显著增加,Bcl-2/Bax的蛋白表达率明显降低,致使线粒体膜的通透性增高、膜电势显著降低,促进了凋亡诱导因子细胞色素C释放,进而激活了caspase-9, caspase-9的激发引发了caspase的级联反应,最终导致细胞凋亡。Fluopsin C对肿瘤细胞株A172、K562、Hela、MCF-7和MD-MBA-23]的抑制增值作用通过MTT法检测,结果显示Fluopsin C对实验细胞具有非常好的细胞毒活性。同OEL一样,Fluopsin C以时间和浓度依赖的方式显著抑制肿瘤细胞增殖。Fluopsin C对正常细胞株EVC304和HL7702的细胞毒性与肿瘤细胞相比明显降低,表明Fluopsin C对不同细胞的毒性具有选择性,对肿瘤细胞的作用更为敏感。早期我们选取了MCF-7和MD-MBA-231进行作用机理的初步研究。Fluopsin C作用于乳腺癌细胞MCF-7和MD-MBA-231后,用显微镜观察细胞的形态变化,伴随着药物的刺激,细胞出现肿胀变圆、细胞膜起泡,核形态区别于凋亡呈现弥散状态。PI染色后荧光显微镜观察以及流式细胞仪的分析结果可以看出,加药后的乳腺癌细胞坏死率增加,证实了Fluopsin C诱导MCF-7和MD-MBA-231细胞死亡可以通过胀亡方式。选取MCF-7细胞进行胀亡机制的研究,2μM Fluopsin C处理MCF-7细胞1h左右细胞膜开始起泡,细胞膜的通透性增加,细胞内乳酸脱氢酶LDH和其他核酸类内容物开始释放,伴随着药物的持续刺激,内容物释放量持续增加,9h时达到峰值；与此同时,细胞内ATP水平与对照组相比显著降低,8h左右降低到正常水平的30%,ROS的产生增加,线粒体的膜电势显著降低,免疫荧光染色技术和Western Blot分析了细胞骨架相关蛋白β-actin和α-tublin的变化,结果显示这两种蛋白被降解,细胞骨架受到破坏。本论文首次研究了新型桉烷内酯化合物OEL的抗肿瘤活性和诱导乳腺癌MCF-7细胞死亡的作用机理；也是第一次对Fluopsin C的抗肿瘤作用机制进行了初步研究,首次发现Fluopsin C通过胀亡的方式诱导肿瘤细胞死亡。由于凋亡时,细胞膜保持完整性,不存在内容物释放,对周围的组织影响不大；而在胀亡时,细胞膜被破坏,细胞内容物释放,引起周围组织炎症反应,因而本文为以后OEL和Fluopsin C进入临床,合理用药达到更好的治疗肿瘤作用提供了依据。

全文目录

摘要  10-12
Abstract  12-15
符号说明  15-16
第一章前言  16-40
  第一节研究背景  16-19
  第二节细胞死亡方式的研究进展  19-34
    一凋亡  19-29
    二胀亡  29-31
    三凋亡、胀亡与坏死之间的联系和区别  31-34
  参考文献  34-40
第二章 OEL诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡的机制研究  40-61
  1 实验材料  40-42
    1.1 细胞株  40
    1.2 药品及试剂  40-41
    1.3 试剂配制  41-42
    1.4 实验仪器  42
  2 实验方法  42-47
    2.1 细胞复苏及培养  42-43
    2.2 MTT法检测药物的细胞毒性  43
    2.3 细胞形态学观察  43
    2.4 凋亡的检测  43-44
    2.5 线粒体膜电势的检测  44
    2.6 细胞全蛋白的提取  44
    2.7 分离线粒体,细胞核和细胞液  44-45
    2.8 蛋白含量的测定  45
    2.9 Western Blot分析  45-47
    2.10 活性氧检测  47
  3 实验结果  47-55
    3.1 MTT实验结果  47-49
    3.2 OEL诱导MCF-7细胞核的形态变化  49
    3.3 OEL诱导MCF-7细胞凋亡率的检测  49-51
    3.4 OEL对线粒体的影响  51
    3.5 OEL对凋亡相关蛋白的影响  51-53
    3.6 OEL对MCF-7细胞内活性氧(ROS)的影响  53-55
  4 讨论  55-56
  5 小结  56-57
  参考文献  57-61
第三章 FLUOPSIN C诱导乳腺癌细胞胀亡的机制研究  61-85
  1 实验材料  61-63
    1.1 细胞株  61
    1.2 药品及试剂  61-62
    1.3 试剂配制  62
    1.4 实验仪器  62-63
  2 实验方法  63-67
    2.1 细胞复苏及培养  63-64
    2.2 MTT法检测药物的细胞毒性  64
    2.3 活细胞实时观察  64
    2.4 PI染色分析  64
    2.5 LDH检测  64-65
    2.6 A260检测  65
    2.7 免疫荧光分析细胞骨架蛋白  65-66
    2.8 Western Blot分析  66
    2.9 细胞内ATP水平检测  66-67
    2.10 活性氧水平的检测  67
    2.11 线粒体膜电势的检测  67
  3 实验结果  67-80
    3.1 MTT实验结果  67-70
    3.2 Fluopsin C诱导乳腺癌细胞MCF-7和MD-MBA-231死亡的形态变化  70-72
    3.3 PI的染色分析  72-74
    3.4 LDH检测分析  74-75
    3.5 OD_(260)的吸收检测  75-76
    3.6 Fluopsin C对细胞骨架的影响  76-78
    3.7 Fluopsin C对ATP水平的影响  78
    3.8 Fluopsin C对ROS水平的影响  78-79
    3.9 Fluopsin C对线粒体膜电势的影响  79-80
  4 讨论  80-82
  5 小结  82
  参考文献  82-85
致谢  85-86
攻读学位期间发表的论文  86-88
学位论文评阅及答辩情况表  88

OEL和Fluopsin C的抗肿瘤活性及机制研究

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