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基于肝微粒体的T-2毒素体外代谢研究

作　者: 林妮妮
导　师: 谢剑炜
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物分析学
关键词: T-2毒素肝微粒体代谢产物种属差异 CYP450酶酯酶代谢动力学
分类号: R969.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

作为单端孢霉烯族类真菌毒素的重要代表，T-2毒素在目前已知的该类毒素中毒性最强，因其高毒性，T-2毒素被视为潜在的化学毒剂之一；另外，其亦是自然界存在的最危险的食品污染源之一，近年来对粮农作物造成了广泛污染，对人类的身体健康、食品安全等方面产生了巨大威胁。因此，T-2毒素的相关研究是近年来的研究热点之一。T-2毒素在体内代谢速率较快，其体内持续毒性主要由代谢产物的毒性引起。因此，为深入阐明其毒性，对T-2毒素的代谢研究尤为重要。以替代(replacement)、减少(reduction)和优化(refinement)动物试验为核心的“3R”运动逐渐被国际社会广泛接受。肝脏是药物毒物最重要的代谢器官，是生物转化的主要场所。以肝脏为基础的体外替代实验，如肝微粒体和肝细胞，在“3R”运动中起着重要的作用，其以特有的优势和特点在外源性物质代谢和毒性的研究中得到广泛应用。本论文即旨在研究基于肝微粒体的T-2毒素的体外代谢，包括T-2毒素在肝微粒体中代谢的种属差异性，特别是T-2毒素在人肝微粒体中的代谢行为及和动物之间的代谢差异性，研究不同酶系对T-2毒素的代谢作用，期望为T-2毒素代谢机理、代谢与毒性的关系以及与人类健康的风险评估、食品安全研究等提供实验资料和科学依据。本论文共分为六章，第一章为文献综述，引述文献70余篇，主要论述了近年来T-2毒素在分析方法、体内外代谢等方面的研究进展。第二章为T-2毒素的两种代谢物即HT-2毒素、3’-OH T-2毒素的参考品制备部分。在分离纯化基础上，对之进行了结构表征；采用玉米酯酶对T-2毒素进行特异性转化，制备HT-2毒素，产率高达80%以上，该酶催化方法具有定向催化、条件温和及产率高等特点；采用体外肝S9体系生物转化的方法，将T-2毒素定向转化为3’-OH T-2毒素，产率达30%以上。为后续的研究提供了物质基础；在此基础上，第三章建立了基于液相色谱-质谱技术的T-2毒素及其主要代谢物的同时定量分析检测方法。包括T-2毒素及3’-OH T-2毒素在苯巴比妥诱导的大鼠肝S9中的定量检测方法，及T-2毒素及其五种代谢物在肝微粒体和全血中的分析检测方法。所建方法简单快速，灵敏度高，其回收率、精密度和准确度均符合生物样品定量分析的要求，展示了其用做体内外代谢动力学的良好应用前景；第四章的体外代谢研究表明，T-2毒素的肝微粒体代谢存在种属差异性，肝固有清除率依次为人＞小鼠＞猴＞比格犬＞大鼠，然而肝清除率的顺序为小鼠＞猴＞大鼠＞比格犬＞人；不同种属肝微粒体对T-2毒素的亲和力和代谢能力存在差异。第五章为T-2毒素在不同酶体系的体外代谢研究。在人肝微粒体中，多种细胞色素P450（CYP）同工酶参与了T-2毒素的代谢，包括CYP3A4、CYP2E1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2B6、CYP2D6、CYP2C19，其中CYP3A4为主要的代谢同工酶，主要以羟基化产物为主；肝微粒体中酯酶对T-2毒素代谢作用明显，主要产物为HT-2毒素。不同酶系对T-2毒素的代谢速率不同，在人、比格犬、大鼠、小鼠肝微粒体中以酯酶代谢为主要贡献，而在猴肝微粒体中以CYP450酶系代谢为主要贡献。第六章推测总结了T-2毒素及其主要代谢物的电喷雾质谱碎裂规律，以此为基础推测发现了6种可能的T-2毒素新代谢物，并推测了部分产物结构。

全文目录

英文缩略词表  7-9
摘要  9-11
Abstract  11-14
第一章前言  14-23
  1.1 T-2 毒素介绍  14-15
  1.2 T-2 毒素的毒性  15
  1.3 T-2 毒素的分析检测方法  15-18
    1.3.1 前处理方法  15-16
    1.3.2 分析检测方法  16-18
  1.4 T-2 毒素代谢研究  18-21
    1.4.1 体外代谢研究  18-20
    1.4.2 体内代谢研究  20-21
  1.5 本课题的立题依据  21-23
第二章 HT-2 毒素、3’-OH T-2 毒素的制备  23-33
  2.1 引言  23-24
  2.2 实验部分  24-26
    2.2.1 仪器、材料和试剂  24-25
    2.2.2 HT-2 毒素的制备及鉴定  25-26
      2.2.2.1 玉米酯酶的提取及纯化  25
      2.2.2.2 玉米酯酶活力及蛋白质含量的测定  25
      2.2.2.3 玉米酯酶的表征  25
      2.2.2.4 HT-2 的制备及纯化  25-26
    2.2.3 3’-OH T-2 毒素的制备及表征  26
      2.2.3.1 孵育条件优化  26
  2.3 结果与讨论  26-32
    2.3.1 HT-2 转化条件的探讨  26-27
    2.3.2 HT-2 毒素鉴定  27-30
    2.3.3 3’-OH T-2 毒素制备条件考察  30-31
    2.3.4 3’-OH T-2 毒素制备、纯化及鉴定  31-32
  2.4 本章小结  32-33
第三章 T-2 毒素及其主要代谢物分析方法的建立  33-48
  3.1 引言  33
  3.2 实验部分  33-36
    3.2.1 仪器、材料和试剂  33-34
    3.2.2 仪器条件  34
    3.2.3 苯巴比妥诱导的大鼠肝 S9 中 T-2 毒素及 3’-OH T-2 的检测方法建立  34-35
      3.2.3.1 苯巴比妥诱导的肝 S9 制备  34-35
      3.2.3.2 样品制备  35
    3.2.4 肝微粒体中 T-2 毒素及五种主要代谢物的检测方法建立  35
    3.2.5 大鼠血浆中 T-2 毒素及五种主要代谢物的检测方法建立  35-36
      3.2.5.1 样品制备  35
      3.2.5.2 样品前处理  35-36
    3.2.6 方法学验证  36
    3.2.7 血浆孵育  36
  3.3 结果与讨论  36-47
    3.3.1 色谱条件的优化  36-37
    3.3.2 内标选择  37-38
    3.3.3 质谱条件的优化  38-39
    3.3.4 线性范围、检出限和定量限  39-47
      3.3.4.1 苯巴比妥诱导的大鼠肝 S9 中线性范围、检出限和定量限  39-40
      3.3.4.2 苯巴比妥诱导的大鼠肝 S9 中精密度、回收率和基质效应  40
      3.3.4.3 大鼠肝微粒体中线性范围、检出限和定量限  40-41
      3.3.4.4 大鼠肝微粒体中精密度、回收率和基质效应  41-42
      3.3.4.5 固相萃取条件优化  42-44
      3.3.4.6 大鼠血浆中线性范围、检出限和定量限  44
      3.3.4.7 大鼠血浆中精密度、回收率和基质效应  44-45
      3.3.4.8 大鼠血浆中 T-2 毒素及其主要代谢物稳定性  45-46
      3.3.4.9 大鼠血浆中的 T-2 毒素代谢行为  46-47
  3.4 本章小结  47-48
第四章 T-2 毒素的体外代谢  48-61
  4.1 引言  48
  4.2 实验部分  48-50
    4.2.1 仪器、材料和试剂  48-49
    4.2.2 实验方法  49-50
      4.2.2.1 肝微粒体中消长动力学  49
      4.2.2.2 线性动力学的最佳微粒体蛋白浓度  49
      4.2.2.3 肝微粒体中各代谢物定量比较  49
      4.2.2.4 酶代谢动力学  49
      4.2.2.5 数据处理与分析  49-50
  4.3 实验结果  50-59
    4.3.1 T-2 毒素及其主要代谢物在不同种属肝微粒体中的消长动力学  50-53
    4.3.2 线性动力学的最佳微粒体蛋白浓度  53
    4.3.3 肝微粒体中各代谢物的定量比较  53-55
    4.3.4 酶代谢动力学  55-59
      4.3.4.1 肝微粒体酶系动力学  55-59
  4.4 本章小结  59-61
第五章 T-2 毒素在不同酶系中的体外代谢  61-73
  5.0 引言  61
  5.1 CYP450 酶对 T-2 毒素的代谢  61-67
    5.1.1 实验部分  62-63
      5.1.1.1 仪器、材料和试剂  62
      5.1.1.2 实验方法  62-63
        5.1.1.2.1 Cocktail 法测定人、猴、比格犬、大鼠、小鼠中 CYP450 酶活性  62-63
        5.1.1.2.2 同工酶抑制剂法  63
        5.1.1.2.3 重组酶法  63
    5.1.3 实验结果  63-67
      5.1.3.1 同工酶酶活测定结果  63-64
      5.1.3.2 同工酶抑制剂法  64-66
      5.1.3.3 整体归一化法评价各同工酶的贡献  66-67
    5.1.4 结果与讨论  67
  5.2 不同酶系对 T-2 毒素的代谢  67-71
    5.2.1 实验部分  67-68
      5.2.1.1 考察非 CYP450 酶系的代谢作用  67-68
      5.2.1.2 抑制剂的选择  68
      5.2.1.3 T-2 毒素在酯酶中的消长动力学  68
      5.2.1.4 T-2 毒素在 CYP450 酶中的消长动力学  68
      5.2.1.5 T-2 毒素在酯酶中的消长动力学  68
    5.2.3 实验结果  68-71
      5.2.3.1 非 CYP450 酶系的代谢作用  68-69
      5.2.3.2 抑制剂的选择  69-70
      5.2.3.4 CYP450 酶对 T-2 毒素的代谢作用  70
      5.2.3.5 羧酸酯酶对 T-2 毒素的代谢作用  70-71
    5.2.4 结果讨论  71
  5.3 本章小结  71-73
第六章 T-2 毒素代谢物的鉴定  73-82
  6.1 引言  73
  6.2 实验部分  73-74
    6.2.1 仪器、材料和试剂  73
    6.2.2 实验方法  73-74
      6.2.2.1 T-2 毒素及其主要代谢物在 Q-TOF/MS 和 IT-MS 上的质谱行为  73-74
      6.2.2.2 T-2 毒素孵育后代谢产物鉴定  74
  6.3 结果与讨论  74-80
    6.3.1 T-2 毒素及其主要代谢物在 Q-TOF/MS 和 IT-MS 上的质谱行为  74-76
    6.3.2 不同种属中 T-2 毒素的代谢物鉴定  76
    6.3.4 T-2 毒素及其主要代谢物的裂解途径  76-80
  6.4 本章小结  80-82
结论  82-84
参考文献  84-94
综述  94-107
  参考文献  101-107
致谢  107-109
附录一  109-110
附录二  110-111
附录三  111-120
附录四  120-122

基于肝微粒体的T-2毒素体外代谢研究

内容摘要

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