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以人转铁蛋白为代表的生物大分子基于LC/MS/MS技术的定量分析研究及临床应用

作　者: 俞颖
导　师: 陈芸
学　校: 南京医科大学
专　业: 药理学
关键词: 节球藻毒素R 人转铁蛋白生物大分子液相色谱-串联质谱法定量分析
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

液相色谱-串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC/MS/MS)是一种基于液相色谱和串联质谱的联用技术，具有高通量、灵敏度高、特异性好、定量限低、操作快速、经济简便等优点，现已广泛运用于医药卫生、环境食品检测等领域。近年来，随着质谱技术的飞速发展，这项技术已经开始应用于复杂生物样品中多肽和蛋白质的测定。节球藻毒素R (Nodularin-R)是一个含有5个氨基酸的肝毒性环肽分子，属于蓝藻毒素的一种，可对人和动物造成肝脏功能紊乱失调。蓝藻毒素主要由蓝藻细菌产生。近些年，蓝藻细菌在中国东部的一些海岸和湖泊迅速繁殖蔓延，导致了水质的污染，从而进一步对人类健康造成危害。然而，目前大多数的检测手段还未能对nodularin-R在生物基质中的水平进行准确定量，因此发展一个能对nodularin-R进行绝对定量的方法极为重要。人转铁蛋白(Human transferrin，hTRF)是人体内一种重要的铁转运蛋白质，主要功能是将体内游离循环的铁结合起来转运至各个细胞中。在临床上的很多疾病(如贫血)诊断治疗中需要对患者的铁代谢水平进行评估，所以要对体内hTRF进行绝对定量。此外，在人血清或其他体液中的hTRF也具备作为生物标记物的潜力，在一些肿瘤疾病的早期发现和诊断中起到提示作用。所以，发展一种高效准确的hTRF定量分析方法显得非常必要。由于免疫学、电化学等分析手段对这两种分子的检测存在特异性和重复性方面的缺点，所以在本研究中我们采用LC/MS/MS技术对人血清中的hTRF以及生物基质(主要是人血清)中的nodularin-R进行了绝对定量。在定量分析nodularin-R实验中，我们采用稳定同位素标记的nodularin-R分子作为内标物，对nodularin-R进行内标法定量分析，并通过固相萃取技术(Solid phase extraction，SPE)对样品进行富集纯化。随后，我们配制了一系列浓度的nodularin-R样品溶液并进行了检测，同时也对定量方法进行了方法学验证。最后，我们将LC/MS/MS的定量手段应用于临床样本中，测定人血清中nodularin-R的含量，并和常用的ELISA测定结果进行比较。在定量分析hTRF实验中，我们选用hTRF结构中一段特异性的酶解产物肽段108EDPQTFYYAVAVVK121代替hTRF本身作为目标物进行定量，并采用内标法，以稳定同位素标记的肽段EDPQTFYYAVAV*V*K为内标物，采用SPE对样品进行纯化富集。之后，我们将LC/MS/MS的定量手段应用于临床样本中，测定人血清中hTRF的含量，并和常用的免疫比浊法测定结果进行比较。Nodularin-R的定量结果显示：标准曲线的线性范围为0.50-100.0ng/mL，质控样品的日内和日间精密度RSD分别小于6.0%和9.8%，定量下限的准确度RE小于2.0%，其他质控样品的准确度RE小于3.4%。LC/MS/MS和ELISA测定结果进行比较后显示，相对于ELISA，LC/MS/MS能够测定浓度更低的nodularin-R样品。然而，这两种方法之间并不存在明显的相关性，回归方程y=1.09x+0.847，r=0.5276(p>0.05)，原因可能在于ELISA由于特异性的局限并不能单独地检测nodularin-R的含量，而只能检测nodularin-R及其类似物的总量，因而不具有相关性。hTRF的定量结果显示：标准曲线的线性范围为500-5000ng/mL，质控样品的日内和日间精密度RSD分别小于4.9%和9.0%，准确度RE小于5.4%，低、中、高质控样品的回收率分别为103.0%，82.2%和98.1%。最终我们成功用该定量方法测定了临床样本中hTRF的含量，LC/MS/MS法测得的结果和免疫比浊法测得的结果比较后显示：两种方法存在良好的相关性，回归方程为y=1.194x-0.457(r=0.9096， p <0.05)。总而言之，LC/MS/MS分析手段具有快速经济、灵敏度高、选择性强、定量限低等优点，尤其在测定低浓度及复杂基质的样品时更能得到可靠的数据。同时，实践证明，LC/MS/MS能够作为一种有效的定量分析手段应用于临床样本的检测。

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中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-13
前言  13-17
1 实验部分  17-26
  1.1 试剂  17-18
  1.2 仪器  18-19
  1.3 样品溶液配制  19-21
    1.3.1 Nodularin-R 贮备液、标准曲线和质控样品的配制  19-21
    1.3.2 hTRF 贮备液、标准曲线和质控样品的配制  21
  1.4 样品前处理  21-23
    1.4.1 Nodularin-R 样品前处理  21
    1.4.2 hTRF 血清样品纯化  21-22
    1.4.3 hTRF 胰蛋白酶水解反应及 SPE 富集纯化  22-23
  1.5 质谱条件  23-25
    1.5.1 液相色谱-串联质谱 (LC/MS/MS)  23-24
    1.5.2 飞行质谱 (MALDI-TOF)  24-25
  1.6 稳定同位素标记的 hTRF 肽段内标物  25
  1.7 方法学验证  25
  1.8 临床样本的方法学评估  25-26
    1.8.1 Nodularin-R 定量方法的临床样本适用性考察  25-26
    1.8.2 hTRF 定量方法的临床样本适用性考察  26
2 结果与讨论  26-47
  2.1 三重四级杆质谱仪中nodularin-R特征性碎片离子的确定  26-30
  2.2 hTRF 酶解效率分析  30-31
  2.3 酶解肽段的电喷雾响应评估  31-34
  2.4 LC/MS/MS 定量结果以及方法学验证  34-41
    2.4.1 Nodularin-R 定量结果及方法学验证  34-38
    2.4.2 hTRF 定量结果及方法学验证  38-41
  2.5 Nodualrin-R 定量方法评估比较  41-44
  2.6 hTRF 定量方法评估比较  44-47
3 结论  47-49
参考文献  49-57
综述  57-78
  参考文献  68-78
攻读硕士学位期间发表论文  78-79
致谢  79-80

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