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Heparosan的提取分离及其对肠道菌作用的研究

作　者: 陈祥娥
导　师: 凌沛学
学　校: 山东大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: heparosan 肝素肠道菌黏附感染
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

heparosan为糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)家族一员,是某些细菌荚膜多糖成分,同时也是肝素和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)的生物合成前体。肝素和HS是生物体很重要的一类多糖物质,参与体内的多种生物过程,如胚胎发育、细胞生长分化、血液凝固、脂质代谢、炎症反应、血管生成,细胞信号传导和微生物感染等。肝素作为重要的抗凝血和抗血栓药物广泛应用于临床,此外,还具有调血脂、抗炎、抗癌等作用。近年来,肝素的抗感染作用受到关注。研究发现,外源性肝素可阻止或抑制多种传染性病原微生物对真核细胞的感染,包括病毒,细菌以及寄生虫。肝素对多种病原微生物的黏附或侵入抑制作用,使其具有开发为广谱抗感染制剂的潜能。由于肝素本身具有很强的抗凝活性,外源性肝素的应用,可引发出血等不良反应,须严格控制剂量和操作,限制了其进一步开发。heparosan的二糖骨架结构与肝素或HS类似,但未硫酸化,也没有将葡糖醛酸异构化为艾杜糖醛酸,不具抗凝活性,可直接细菌发酵提取获得,还可通过硫酸化或异构化修饰生成多种具有相似结构的衍生物。研究发现,heparosan及其衍生物具有多种与肝素类似的活性,如抗凝、抗炎、抗病毒及抗癌等。而heparosan在细菌感染等方面的作用尚未见相关报道。本课题研究了heparosan对部分肠道菌体外黏附及定殖的影响和体内对肠道菌群的整体调节作用以及预防病原菌感染的效果,为其在抗感染方面的开发提供依据。1heparosan的提取分离目的通过多杀性巴氏杆菌D型菌株P-934的培养提取heparosan,并对其进行纯化和鉴定。方法以heparosan产量为主要指标,通过对碳源、金属离子等培养基组成以及接种量、摇瓶装液量等条件的考察,确定最终培养条件。确定heparosan提取纯化的主要工艺步骤,并对影响纯化的关键因素进行优化,实现heparosan的高效分离。参考相关文献报道,对heparosan进行鉴定及含量测定。结果优化后的发酵培养基组成为牛脑心浸粉20g/L,蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L, NaCl5.0g/L, MgSO40.2g/L, MnCl20.5g/L, pH7.2,在250mL锥形瓶中装液量为50mL,接种体积分数为5%,培养周期48h。heparosan产量由脑心浸液培培养基中的0.13g/L增长为0.41g/L。所用提取纯化工艺较为简单,除菌体后,上清液采用氯化十六烷基吡啶沉淀,所得沉淀经氯化钠溶液复溶后醇沉即可得到heparosan。通过对醇沉氯化钠浓度的控制,实现heparosan的高效分离。经肝素酶Ⅲ降解和1H-NMR分析测定,确定所得提取产物为heparosan。本提取分离工艺所得heparosan纯度达98%以上。结论通过对培养条件的改善,提高了野生型菌株heparosan的产量,工艺简便可行,所得heparosan纯度较高,适用于后续实验。2heparosan体外对部分肠道菌黏附和定殖的影响目的考察heparosan体外对常见肠道菌黏附以及定殖的影响。方法通过HT-29细胞培养建立肠道上皮细胞模型,采用黏液素和牛血清白蛋白模拟黏液层主要成分建立黏液层模型,考察heparosan对肠致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和沙门氏菌等常见肠道致病菌以及益生菌鼠李糖乳酸杆菌黏附肠道上皮细胞和黏液层的影响。此外,通过heparosan对金黄色葡萄球菌和鼠李糖乳酸杆菌生物膜形成能力的考察,评价heparosan对生物膜形成菌株定殖的影响。同时对比肝素、硫酸软骨素、透明质酸等常见GAG以及荷正电壳聚糖的作用效果。结果heparosan可抑制部分病原菌的黏附,且抑制作用随浓度增大而增加,50μg/mL heparosan即可显著抑制肠致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和多杀性巴氏杆菌等对HT-29肠道上皮细胞和黏液层模型的黏附,但对鼠李糖乳酸杆菌的黏附则无明显影响。当鼠李糖乳酸杆菌浓度较低时,heparosan可显著增强其对肠致病性大肠杆菌的竞争和抵御作用。heparosan对实验考察菌株的黏附抑制效果与肝素类似,两者之间并无显著性差异。heparosan对病原菌的黏附抑制作用可能因其具有与肝素或HS类似结构。heparosan对鼠李糖乳酸杆菌和金黄色葡萄球菌的生物膜形成无明显影响,而肝素可显著增强鼠李糖乳酸杆菌的生物膜形成,提高幅度达40%以上,这可能主要归因于肝素很强的荷负电性质。结论heparosan对常见病原菌具有显著的黏附抑制作用,而对益生菌无明显影响,可相对增加益生菌的竞争优势。heparosan具有开发为抗病原菌感染制剂的潜在价值。3heparosan对肠道菌群的整体调节作用和体内抗感染效果目的考察heparosan对大鼠肠道菌群的整体调节作用以及体内预防病原菌感染的效果。方法实验大鼠随机分为3组,分别给予生理盐水,0.5mg/mL和1mg/mL heparosan溶液,灌胃剂量为每100g体重1mL,每日给药1次,连续2周。分别取第7日、14日粪便样品,经变性梯度凝胶电泳分析,选取heparosan处理组与生理盐水组差异条带,测序并进行菌群分析,比较肠道菌群组成变化,评价heparosan对优势菌株的影响。实验大鼠采用肠致病性大肠杆菌悬浮液连续灌胃3d,诱发肠炎,考察heparosan对病原菌感染的预防效果。结果与生理盐水组相比,heparosan处理组大鼠肠道菌群中乳酸杆菌属益生菌的比例显著提高。肠致病性大肠杆菌灌注后,生理盐水组大鼠出现明显的肠道炎症反应,而heparosan处理组均未出现。结论heparosan可增加肠道内乳酸杆菌属益生菌的相对数量及优势,有利于维持稳定、健康的肠道内环境。heparosan可有效预防肠致病性大肠杆菌的体内感染。

全文目录

摘要  10-13
ABSTRACT  13-17
符号说明  17-19
第一章前言  19-33
  1 Heparosan及其衍生物  19-29
    1.1 heparosan合酶  20-23
    1.2 heparosan的生产  23-24
    1.3 heparosan及其衍生物的作用  24-29
  2 肝素的抗感染作用  29-31
  3 本课题的研究目的及意义  31-32
  4 本课题的主要研究内容  32-33
第二章 Heparosan的提取与分离  33-47
  1 材料  33-34
    1.1 菌株  33
    1.2 主要仪器  33
    1.3 主要试剂  33-34
    1.4 培养基  34
  2 方法  34-38
    2.1 菌株保藏  34
    2.2 种子培养  34
    2.3 发酵培养  34
    2.4 heparosan的纯化  34-35
    2.5 heparosan的鉴定  35
    2.6 heparosan纯度测定  35-37
    2.7 heparosan分子量的测定  37
    2.8 不同因素对heparosan产量及纯度的影响  37-38
  3 结果  38-46
    3.1 heparosan的鉴定  38-39
    3.2 heparosan的纯度测定  39-41
    3.3 heparosan的分子量  41
    3.4 不同条件对heparosan产量及纯度的影响  41-46
  4 本章小结  46-47
第三章 Heparosan及几种多糖对肠道菌群黏附及菌膜形成的影响  47-64
  1 材料  47-48
    1.1 主要仪器  47
    1.2 主要试剂  47-48
    1.3 菌株及细胞株  48
    1.4 培养基  48
  2 方法  48-50
    2.1 菌株培养  49
    2.2 肠道上皮细胞黏附实验  49
    2.3 黏液层黏附实验  49-50
    2.4 菌膜形成实验  50
    2.5 统计分析  50
  3 结果  50-60
    3.1 对肠道菌黏附上皮细胞的影响  50-55
    3.2 对肠道菌黏附黏膜层的影响  55-59
    3.3 对LGG和S.aureus生物膜形成的影响  59-60
  4 讨论  60-62
  5 本章小结  62-64
第四章 Heparosan对大鼠肠道菌群的影响  64-78
  1 材料  64-65
    1.1 菌株及培养基  64
    1.2 主要试剂  64
    1.3 主要仪器  64-65
    1.4 实验动物  65
  2 方法  65-71
    2.1 动物分组及给药  65
    2.2 标本的采制及观察  65
    2.3 粪便样品总DNA的提取  65-66
    2.4 优势菌株16S V3可变区的PCR扩增  66-67
    2.5 优势菌株组成的变性梯度凝胶电泳  67-69
    2.6 T-载体克隆  69-71
    2.7 测序  71
  3 结果  71-76
    3.1 大鼠状态及体重  71-72
    3.2 大鼠结肠的组织学观察  72
    3.3 优势菌株-PCR结果  72
    3.4 优势细菌组成差异分析  72-76
  4 讨论  76-77
  5 本章小结  77-78
总结与展望  78-80
参考文献  80-93
致谢  93-95
攻读研究生期间发表学术论文  95-96
附录  96-101
学位论文评阅及答辩情况表  101

Heparosan的提取分离及其对肠道菌作用的研究

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