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基于RARα/HDAC双靶点抗癌药物的设计、合成与生物活性研究

作　者: 吴敬德
导　师: 徐文方
学　校: 山东大学
专　业: 药物化学
关键词: 白血病组蛋白去乙酰化酶抑制剂维甲酸类化合物化学合成生物活性评价药动学研究
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

1.立题背景长期以来,白血病一直是威胁人类生命健康的恶性血液疾病,并且随着工业化进程的发展、环境的恶化,诱发白血病的外因逐渐增多,使得白血病的发病率特别是儿童白血病的发病率呈上升趋势。随着分子生物学、细胞生物学的发展,白血病的发病机制研究不断深入,染色体易位、原癌基因及抑癌基因的变异是白血病发病的主要原因,信号通路等的改变对白血病的进程有直接的影响,但由于不同类型的白血病发病机制的差异,造成白血病治疗的复杂性及多变性。维甲酸类化合物是4000余个天然及合成化合物的总称,其中多种化合物已成为肿瘤治疗的一线用药,如全反式维甲酸(ATRA)通过诱导细胞分化作用而成为复发或难治性急性早幼粒细胞白血病(APL)治疗的首选及一线用药；他米巴罗汀(Tamibarotene, AM80),是特异性RARα激动剂,临床主要用于治疗各种类型的APL,由日本Nippon Shinyaku公司开发,2005年6月在日本首次上市(商品名Amnolake)。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)通过参与调控基因的转录而与白血病及其它恶性肿瘤发生、发展密切相关,是肿瘤治疗中一类较新的作用靶点：通过核受体,HDAC可被募集至肿瘤细胞中,使肿瘤细胞中HDAC呈高表达,其后果包括：细胞中基因的正常转录因此受到抑制,最终导致肿瘤的发生；其次,白血病及其它恶性肿瘤中往往存在细胞的异常增殖及分化受阻,这与影响细胞生长及分化的相关蛋白的静默相关,而这些蛋白的静默是启动子区域DNA的异常甲基化,以及包含组蛋白去乙酰化在内的染色体结构发生改变的结果。这种HDAC与恶性肿瘤发生、发展间的相关性是寻找及研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)的理论基础。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)按结构特点共分6大类,目前已有部分组蛋白去乙酰化酶抑制剂被批准上市,还有10多个处于临床试验阶段。组蛋白去乙酰化酶抑制剂能够缓解特定致癌基因产物引起的转录抑制,已证实在白血病及其它恶性肿瘤的治疗中具有确切的疗效,其对白血病的治疗机制主要包括：诱导细胞分化,特别是对ATRA产生耐药的病人尤其显著：HDACIs通过抑制HDAC活性,消除特定靶细胞组蛋白去乙酰化,使得白血病细胞恢复对ATRA的敏感性；其它作用机制还包括诱导白血病细胞的凋亡及抑制增殖；细胞周期阻滞等等。组蛋白去乙酰化酶抑制剂的优点在于,靶向性较好,相应地毒副作用较小缺点是生物利用度低、代谢快。目前已有多个HDACIs进入临床试验阶段,SAHA是FDA批准的第一个上市的HDACIs。2.目标化合物的设计对已有的HDACIs结构进行分析发现,HDACIs的结构一般由三部分组成：疏水性基团、连接基团及锌离子螯合基团。基于已知HDAC抑制剂(如SAHA)的三维结构及其与酶的结合模型,根据药物设计的拼合原理,同时借鉴前药及多靶点药物理论,本文以RARa选择性激动剂他米巴罗汀(AM80)为疏水性基团,以异羟肟酸、羧基等作为锌离子螯合基团,通过酯键或酰胺键(连接基团)将二者融合,设计合成了一系列结构全新的HDAC抑制剂。目标化合物进入到体内后,通过抑制HDAC的活性,从而抑制白血病细胞的增殖、促进其分化和诱导其凋亡,同时,其在体内酯酶或酰胺酶催化下可代谢释放出AM80, AM80作用于RARa受体而诱导白血病细胞的分化和抑制其增殖而发挥白血病治疗作用,实现与前体药物的协同调节作用。3.目标化合物的合成本研究以2,5-二甲基-2,5-己二醇为起始原料,经过卤代、付-克烷基化、硝化、催化氢化、酰化、缩合反应,然后经酯水解反应得到关键中间体他米巴罗汀(AM80)。最后他米巴罗汀与邻苯二胺,盐酸羟胺,羟基乙酸,甘氨酸等进行近一步的缩合得到目标化合物。目标化合物和具有全新结构的中间体化合物采用1H-NMR、ESI-MS谱进行了结构确证。4.目标化合物生物活性评价对所合成化合物进行了体外的初步活性评价。体外抑酶试验中,采用HDAC(HDAC试剂盒、Hela细胞提取物和HDAC-8)、氨肽酶-N和明胶酶三种酶分别进行活性筛选。验结果表明所有的目标化合物对HDAC有选择性抑制作用,其中化合物10b和12b对HDAC的抑酶活性与阳性对照SAHA相当。体外细胞实验通过MTT法测定了化合物10b和12b对人卵巢透明细胞癌ES-2,人结肠癌细胞株HCT116,人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,人慢性粒细胞白血病细胞株K562,人急性早幼粒白血病细胞株HL-60和NB4以及人前列腺癌细胞株PC-3的增殖抑制活性。结果表明化合物10b和12b对ES-2细胞、PC-3细胞、K562细胞及HL-60细胞的抑制活性均优于阳性对照SAHA,对HCT116细胞、MDA-MB-231细胞及NB4细胞的抑制活性均略弱于阳性对照SAHA。10b对HL-60及NB4细胞的抑制活性明显优于对照组AM80,12b对NB4细胞的抑制活性亦明显优于AM80。5.药动学研究选取具有较好抑酶活性和增殖抑制活性的目标化合物12b和10b,以已批准上市的RARa受体选择性激动剂AM80为阳性对照药,采用口服和静脉注射两种给药途径研究了目标化合物在Wistar大鼠体内的药物动力学特性。结果显示,静注给药后,10b在血浆中以独立分子存在,5min至11h可持续释放出AM80,并且10b作为AM80的前体药物,与AM80单独给药相比,各药动学参数均有较大改变,如使AM80的MRT从4.44h延长到18.09h,t1/2从2.22h延长到3.88h,Tmax也从0.08h延长到4h,这些结果显示10b静注可以很好地和其前体药物发挥协同治疗作用。与静注给药相比,10b和12b口服给药均显示较低的生物利用度,血浆中仅检测到少量的前体药物及AM80。6.总结与展望本研究以他米巴罗汀为基本结构骨架设计合成了19个目标化合物,并对其进行了体外初步活性评价。其中,化合物10b和12b在体外表现出较好的抑酶活性及对多株肿瘤细胞很强的增殖抑制活性。体内药动学研究结果表明目标化合物可代谢释放出AM80,与其前体药物HDAC抑制剂形成协同治疗、调节作用,使其具有多靶点效应。这些化合物是很有研究前景的先导化合物,对于开发新一代HDAC抑制剂类抗肿瘤药物具有重要意义。

全文目录

摘要  10-13
ABSTRACT  13-16
符号说明  16-18
第一章前言  18-77
  1.1 白血病的发病机理  18-33
    1.1.1 染色体易位  18-23
    1.1.2 信号通路与白血病  23-29
    1.1.3 原癌基因及抑癌基因与白血病  29-33
  1.2 维甲酸类化合物在白血病治疗中的作用  33-46
    1.2.1 维甲酸受体结构和功能  33-36
    1.2.2 受体相关的维甲酸类化合物的分类  36-41
    1.2.3 维甲酸类化合物的构效关系研究及生物学作用  41-44
    1.2.4 维甲酸类化合物与白血病治疗  44-45
    1.2.5 维甲类化合物副作用及局限性  45-46
  1.3 组蛋白去乙酰化酶抑制剂与白血病治疗  46-56
    1.3.1 组蛋白去乙酰化酶家族及其在肿瘤中的表达及功能  46-51
    1.3.2 组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACIs)的分类、结构、研究进展  51-54
    1.3.3 HDAC抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACIs)抗白血病的主要作用机制  54-56
  1.4 基于RARα/HDAC双靶点抗癌药物的研究现状与临床意义  56-58
  参考文献  58-77
第二章目标化合物的设计  77-83
  2.1 前药原理  77
  2.2 协同前药  77-78
  2.3 拼合原理  78
  2.4 以AM80为基本结构的新型抗癌药物设计  78-82
    2.4.1 目标化合物设计思路  78
    2.4.2 目标化合物结构设计  78-80
    2.4.3 AM80-HDACI系列衍生物  80-82
  参考文献  82-83
第三章目标化合物的合成  83-98
  3.1 目标化合物的合成路线  83-84
  3.2 目标化合物的合成与结构确证  84-94
  3.3 实验讨论  94-96
  参考文献  96-98
第四章目标化合物的初步生物活性评价  98-113
  4.1 体外抑酶活性  98-107
    4.1.1 目标化合物抑制组蛋白去乙酰化酶的活性实验  98-101
    4.1.2 目标化合物抑制氨肽酶N及MMP-2的活性实验  101-105
    4.1.3 抑酶活性实验总结  105-107
  4.2 体外抑制肿瘤细胞增殖活性  107-110
    4.2.1 实验原理  107-108
    4.2.2 实验材料  108
    4.2.3 实验方法  108-109
    4.2.4 实验结果与讨论  109-110
  4.3 裸鼠体内抗白血病细胞U937活性实验  110-112
    4.3.1 实验材料  110
    4.3.2 实验方法  110-111
    4.3.3 实验结果  111-112
  参考文献  112-113
第五章目标化合物的初步药物动力学研究  113-149
  5.1 体外稳定性实验  113-138
    5.1.1 仪器  113
    5.1.2 试药  113-114
    5.1.3 实验动物  114
    5.1.4 化合物在人工胃液和人工肠液中的稳定性研究  114-121
    5.1.5 化合物在人血浆和大鼠血浆中的稳定性  121-130
    5.1.6 化合物在大鼠肝匀浆中的稳定性  130-138
  5.2 药物动力学初步研究  138-147
    5.2.1 仪器  138
    5.2.2 试药  138
    5.2.3 实验动物  138
    5.2.4 药物动力学初步研究  138-146
    5.2.5 结果与讨论  146-147
  参考文献  147-149
第六章总结与展望  149-152
  6.1 研究总结  149-151
    6.1.1 目标化合物的设计  149
    6.1.2 目标化合物的合成  149
    6.1.3 目标化合物的体外生物活性评价  149-150
    6.1.4 目标化合物的体内初步药物动力学研究  150
    6.1.5 创新点  150-151
  6.2 研究展望  151-152
致谢  152-153
攻读学位期间发表的学术论文目录  153-154
附录Ⅰ 目标化合物的1H-NMR,ESI-MS图谱  154-174
附录Ⅱ 英文文章  174-203
学位论文评阅及答辩情况表  203

基于RARα/HDAC双靶点抗癌药物的设计、合成与生物活性研究

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