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水溶性单壁碳纳米管肿瘤靶向给药系统的构建和热疗研究

作　者: 王蕾
导　师: 张振中
学　校: 郑州大学
专　业: 药物化学
关键词: 单壁碳纳米管 聚乙烯亚胺 共价功能化 肿瘤靶向 siRNA 热疗
分类号: R943
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


单壁碳纳米管(SWNTs)是一种特殊的纳米材料,具有许多独特的物理学、化学和生物学特性,自被发现之日起,它就引起了人们广泛的关注。近年来,SWNTs的应用跨越了多个学科和领域,人们一直致力于研究SWNTs潜在的生物医学相关的应用。但是SWNTs具有高度疏水的表面,不溶于水以及常见的有机溶剂,生物相容性差严重限制了其在生物医学中的应用。因此,改善SWNTs的生物相容性是解决SWNTs生物医学应用的首要问题。由于SWNTs具有较强的跨细胞膜能力,因此适当功能化的SWNTs能够携带多种有机或无机粒子(其中包括蛋白质、核酸和化学药物等活性分子)进入细胞内部并且不表现出毒性。传统物理功能化的方法,可以使碳纳米管达到分散的目的,但是物理功能化的方法经常伴随着表面活性剂毒性高、在体内容易解聚等缺点,在实际应用中十分有限。因此,构建具有肿瘤靶向性的化学功能化碳纳米管具有科学意义和广泛的应用前景。生物系统对700-1,100nm范围的近红外光具有高度透过性,而SWNTs在此范围内具有高吸收的特性,可以利用SWNTs在此范围内的光热转换特性对肿瘤进行激光热疗。将SWNTs肿瘤靶向给药系统和激光热疗联合应用可以达到更加有效的抗肿瘤作用。本论文主要构建了聚乙烯亚胺(PEI)共价功能化的SWNTs肿瘤靶向给药系统,并且研究了该给药系统在裸鼠体内和体外的抗肿瘤活性作用及其联合热疗的抗肿瘤活性作用,其主要内容如下：1.SWNT-PEI的合成及表征。通过纯化、氧化、氨基化和PEI聚合化等步骤对SWNTs进行化学功能化。使用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、核磁共振(NMR)、透射电镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)、热重分析(TGA)、粒度分析(PSD)等仪器对所合成的SWNTs样品进行表征。结果表明,经过一系列的化学功能化,在SWNTs表面有聚合化的PEI形成,并且SWNTs本身的结构基本无变化,具有良好的粒径分布,能够在数星期甚至数月中保持稳定。2. SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统的构建。在SWNT-PEI中加入一定量的二硬脂酸磷脂酰胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG2000-Maleimide),通过π-π堆积连接在SWNTs上,利用其尾端的马来酰亚胺通过巯基连接含有NGR基序(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸,Asn-Gly-Arg)的多肽序列,使SWNTs载体系统具有肿瘤血管靶向性。通过静电相互作用,使带负电的hTERTsiRNA与SWNT-PEI载体结合形成肿瘤治疗靶向给药系统。使用紫外全波长扫描和琼脂糖凝胶电泳(AGE)确定SWNTs载体系统荷载siRNA的情况；利用荧光分光光度法检测NGR靶头的连接情况；考察靶向给药系统的载药性能和稳定性。结果表明,SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统荷载siRNA完全,成功连接了NGR多肽靶向基团。结果表明,SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统具有较好的稳定性和生物相容性。3.考察SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统对PC-3人前列腺癌细胞的抗肿瘤活性。使用苯磺罗丹明B(SRB)法考察空白载体对肿瘤细胞的毒性作用及靶向给药系统对肿瘤细胞存活率的影响；使用荧光显微镜考察不同时间内肿瘤细胞对载体系统的摄取情况；通过流式细胞仪分析肿瘤细胞的凋亡情况；通过RT-PCR和Western Blotting分析细胞内hTERT mRNA和蛋白的表达情况。结果表明,SWNT-PEI空白载体在剂量范围内对PC-3人前列腺癌细胞毒性很小；SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向载体系统能够在4h内被细胞摄取完全,且转染率约为单纯PEI的两倍；释放的siRNA能够显著抑制细胞内hTERTmRNA和蛋白的表达,并且使细胞产生凋亡。4.考察SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统对裸鼠主要器官的毒性作用、体内分布及对PC-3荷瘤裸鼠肿瘤的抑瘤效果。以PC-3荷瘤裸鼠为研究对象,通过对裸鼠心、肝、脾、肺和肾组织的HE染色切片分析,证明了靶向给药系统对裸鼠主要脏器在剂量范围内没有明显毒性；利用量子点(QDs)对SWNTs载体系统进行标记,考察了SWNTs载体在裸鼠体内的生物分布情况；通过定期测量荷瘤裸鼠肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线,证明了SWNT-PEI/siRNA/NGR对肿瘤有明显抑制作用；体内肿瘤RT-PCR、Western和凋亡检测结果表明,载体系统可以有效抑制hTERT mRNA、蛋白的表达,并且能够促使细胞凋亡5.考察SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向载体系统联合热疗的抗肿瘤效果,对808nm近红外激光热疗效果进行了体内和体外的评价。808nm激光热疗体外结果显示,SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向载体系统的发热效率具有SWNTs浓度依赖性和时间依赖性；SWNT-PEI/siRNA/NGR联合热疗组与各对照组相比,对PC-3肿瘤细胞的增值有明显的抑制作用；通过对裸鼠肿瘤体积的考察,热疗组治疗效果明显优于单纯载体系统组。通过本论文中的方法构建的SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统无论在体内还是在体外都具有良好的抗肿瘤活性,并且将siRNA基因沉默治疗和热疗进行联合后对SWNTs肿瘤靶向给药系统的抗肿瘤活性更加显著。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-11
英文縮略词表  11-19
前言  19-21
第1章 绪论  21-43
  1.1 引言  21-22
  1.2 碳纳米管的结构和性能  22-23
  1.3 碳纳米管的制备  23-24
  1.4 碳纳米管的毒性  24-25
    1.4.1 碳纳米管的体外毒性  24
    1.4.2 碳纳米管的体内毒性  24-25
  1.5 碳纳米管的功能化  25-29
    1.5.1 碳纳米管的非共价功能化  25-27
    1.5.2 碳纳米管的共价功能化  27-29
  1.6 功能化碳纳米管作为载体的应用  29-32
    1.6.1 碳纳米管荷载蛋白质  30
    1.6.2 碳纳米管荷载核酸  30-32
    1.6.3 碳纳米管荷载化学药  32
    1.6.4 碳纳米管荷载中药  32
  1.7 碳纳米管的体内分布  32-34
  1.8 本课题的主要研究内容  34-36
  参考文献  36-43
第2章 SWNT-PEI的制备及性质考察  43-60
  2.1 引言  43-44
  2.2 实验材料  44-45
    2.2.1 仪器  44-45
    2.2.2 试剂  45
  2.3 实验方法  45-49
    2.3.1 单壁碳纳米管的纯化  45-46
    2.3.2 单壁碳纳米管的羧基化  46
    2.3.3 单壁碳纳米管的氨基化  46-47
    2.3.4 单壁碳纳米管的PEI聚合化  47
    2.3.5 傅立叶红外光谱(FT-IR)  47
    2.3.6 核磁共振图谱(NMR)  47-48
    2.3.7 透射电镜(TEM)  48
    2.3.8 原子力显微镜(AFM)  48
    2.3.9 粒径和电位考察  48-49
    2.3.10 热重分析(TGA)  49
    2.3.11 功能化SWNTs水溶性考察  49
  2.4 结果与讨论  49-59
    2.4.1 单壁碳纳米管的纯化  49-50
    2.4.2 单壁碳纳米管的羧基化  50-52
    2.4.3 单壁碳纳米管的氨基化  52-54
    2.4.4 单壁碳纳米管的聚合化  54-57
    2.4.5 SWNT-PEI溶液的稳定性  57-59
  2.5 本章小结  59-60
第3章 SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统的构建和体外研究  60-101
  3.1 引言  60-61
  3.2 实验材料  61-66
    3.2.1 仪器  61-62
    3.2.2 试剂  62-64
    3.2.3 试剂配制  64-66
    3.2.4 siRNA序列及引物序列  66
    3.2.5 NGR多肽序列  66
  3.3 实验方法  66-77
    3.3.1 SWNTs含量测定方法的建立  66-67
    3.3.2 SWNT-PEI/siRNA载体系统的构建  67-68
    3.3.3 SWNT-PEI/siRNA/NGR载体系统的构建  68
    3.3.4 SWNT-PEI/siRNA/NGR载体系统的包封情况  68
    3.3.5 NGR靶向修饰的验证  68-69
    3.3.6 SWNT-PEI/siRNA/NGR载体系统的稳定性  69
    3.3.7 细胞的培养方法  69-70
    3.3.8 免疫细胞化学染色  70-71
    3.3.9 SWNTs载体系统体外细胞摄取实验  71
    3.3.10 SWNTs载体系统细胞转染率测定  71-72
    3.3.11 SRB法测定载体系统对细胞存活率的影响  72
    3.3.12 RT-PCR实验  72-75
    3.3.13 Western Blotting实验  75-77
    3.3.14 细胞凋亡实验  77
  3.4 结果与讨论  77-100
    3.4.1 SWNTs含量的测定  78-80
    3.4.2 电泳检测载体系统包封情况  80-81
    3.4.3 UV-Vis检测载体系统荷载siRNA的情况  81-82
    3.4.4 SWNT-PEI/siRNA/NGR载体系统透射电镜(TEM)检测  82-83
    3.4.5 NGR靶向修饰的验证  83-84
    3.4.6 SWNT-PEI/siRNA/NGR包封情况的考察  84-85
    3.4.7 SWNT-PEI/siRNA/NGR稳定性考察  85-86
    3.4.8 免疫细胞化学  86-88
    3.4.9 SWNTs载体系统体外细胞摄取实验  88-91
    3.4.10 SWNTs载体系统体外细胞转染率测定  91-92
    3.4.11 SRB法测定细胞存活率  92-94
    3.4.12 RT-PCR实验结果  94-96
    3.4.13 Western Blotting实验结果  96-98
    3.4.14 细胞凋亡实验结果  98-100
  3.5 本章小结  100-101
第4章 SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统的体内研究  101-125
  4.1 引言  101
  4.2 实验材料  101-103
    4.2.1 仪器  101-102
    4.2.2 材料  102-103
  4.3 实验方法  103-108
    4.3.1 荷瘤裸鼠模型的建立  103
    4.3.2 SWNTs载体系统对裸鼠体内主要器官的影响  103-104
    4.3.3 SWNT-PEI/NGR/QDs的制备  104-105
    4.3.4 SWNTs载体系统在裸鼠体内的分布  105
    4.3.5 肿瘤生长抑制率的考察  105-106
    4.3.6 RT-PCR检测裸鼠肿瘤中的hTERT mRNA的表达  106
    4.3.7 Western检测体内肿瘤中hTERT蛋白的表达  106-107
    4.3.8 瘤组织凋亡研究  107-108
  4.4 结果与讨论  108-124
    4.4.1 裸鼠PC-3肿瘤模型的制备  108-109
    4.4.2 SWNTs载体系统对裸鼠体重和主要脏器的影响  109-112
    4.4.3 SWNT-PEI/NGR/QDs的制备  112-113
    4.4.4 SWNTs载体在裸鼠体内的分布  113-118
    4.4.5 载体系统对裸鼠肿瘤的抑制作用  118-119
    4.4.6 载体系统对裸鼠肿瘤中hTERT mRNA表达的影响  119-121
    4.4.7 载体系统对裸鼠肿瘤中hTERT蛋白表达的影响  121-122
    4.4.8 载体系统对裸鼠肿瘤的凋亡作用  122-124
  4.5 本章小结  124-125
第5章 SWNT-PEI/siRNA/NGR肿瘤靶向给药系统的热疗研究  125-136
  5.1 引言  125
  5.2 实验材料  125-127
    5.2.1 仪器  125-126
    5.2.2 试剂  126-127
  5.3 实验方法  127-128
    5.3.1 激光照射下的发热实验  127
    5.3.2 激光照射下载体系统对细胞存活率的影响  127
    5.3.3 激光照射下SWNTs载体系统在对肿瘤的治疗作用  127-128
    5.3.4 激光照射下裸鼠肿瘤组织的HE染色  128
    5.3.5 激光照射下载体系统对裸鼠肿瘤组织的凋亡作用  128
  5.4 结果与讨论  128-135
    5.4.1 体外发热实验  128-129
    5.4.2 激光照射下载体系统对细胞存活率的影响  129-131
    5.4.3 激光照射下载体系统对裸鼠肿瘤的治疗作用  131-133
    5.4.4 激光照射下裸鼠肿瘤组织的HE染色  133-134
    5.4.5 激光照射下载体系统对裸鼠肿瘤组织的凋亡作用  134-135
  5.5 本章小结  135-136
全文总结  136-137
参考文献  137-144
致谢  144-145
个人简介  145-146
  一.教育背  145
  二.在读期间发表的文章  145-146
  三.在读期间申请专利  146
  四.在读期间参加的科研项目  146
  五.在读期间参加的学术活动  146
  六.在读期间获得的奖励  146

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药剂学 > 制剂学
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