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生物活性分子检测新方法的研究

作　者: 唐吉军
导　师: 谢剑炜
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物分析学
关键词: 适配体荧光定量PCR 核糖体失活蛋白糖苷酶活性蓖麻毒素重组人促红细胞生成素α 凝血酶 ATP
分类号: R927
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

2000年人类基因序列测定的提前完成,标志着后基因组时代的序幕随之升起。蛋白质组学研究即为其中的重要分支。蛋白质组学旨在发现具有诊断和/或治疗意义的蛋白质,以揭示疾病的发生机制,从而为早期诊断、分子分型、治疗效果以及预后判断提供依据,并寻找可能成为药物作用的新靶点。为了能在分子水平上阐述表达量极低的功能性蛋白质在生理、病理过程中所起到的作用,就必须建立相应的高灵敏度、高特异性的活性蛋白质检测方法。常规的蛋白质检测方法大都基于抗体的免疫分析法而开展,而作为一类新型识别元件,寡核苷酸适配体受到了广泛关注并且在很多应用方面替代免疫分析中的抗体。适配体是一类通过体外指数富集配基的系统进化技术(SELEX)获得的单链寡核苷酸序列(RNA或ssDNA),其可以特异性地结合目标分子,例如无机离子、有机小分子、氨基酸、多肽、蛋白质、整个细胞等。由于核酸适配体与靶分子的相互作用类似于抗原与抗体结合,因此它们又被称为“化学抗体”。而相比抗体,适配体具有一些自身独特的优势,例如易于化学合成与修饰、良好的重现性与稳定性、较好的组织渗透性和很小的免疫原性、以及可扩增性。本论文以我们课题组已筛选获得的特异识别重组人促红细胞生成素α(rHuEPO-α)的适配体807-39 nt作为研究对象,基于适配体的结构特征以及适配体可扩增性,设计了一类具有普适性的高灵敏检测方法。此外,生物毒素作为一类重要的高毒性生物源物质,可作为潜在的生物战剂而被恐怖分子作为实施恐怖活动的工具,同时,其还是一类重要的免疫毒素类抗癌药物。因此,生物毒素的快速检测在军事、反恐和药学领域都存在迫切需要,此亦是本课题组长期致力的研究方向之一。核糖体失活蛋白(RIP)是其中一类重要的生物毒素,其通过抑制蛋白质合成而导致细胞中毒死亡。本论文中,我们以II型核糖体失活蛋白--蓖麻毒素为例,基于其糖苷酶活性建立了高灵敏度的毒素蛋白毒性体外分析新方法。本研究论文分为以下四章。第一章为前言部分,本章节主要综述了适配体的筛选、特性及其在蛋白质分析检测中的应用,以及代表性RIP--蓖麻毒素的理化性质、中毒机理以及不同原理的检测技术的发展状况。本章的最后则归纳了本研究论文的意义、内容与创新点。在第二章中,我们基于适配体的识别能力和可扩增特性,构建了两种经磁珠分离后实时定量PCR检测rHuEPO-α的检测策略。策略A,称为“杂交后识别”:先将适配体与互补链杂交,并通过互补链末端的生物素结合到链霉亲和素偶联的磁珠上,当加入rHuEPO-α后,适配体与靶分子的相互作用导致杂交区的部分双螺旋结构被破坏,适配体序列进入溶液,最后通过测量溶液中适配体的量来推算靶分子的含量;而策略B,即“杂交前识别”,是先将适配体与rHuEPO-α在溶液中充分混合以形成复合物,然后加入较高浓度的已固定在磁珠上的互补链,以结合溶液中游离适配体,通过实时定量PCR技术,测定上清液中适配体的浓度,从而计算出rHuEPO-α的浓度。对两种策略进行了系统优化,经比较,策略B的灵敏度、线性范围、重现性等分析指标更佳,更适于定量测定缓冲液和人工尿液中的rHuEPO-α,在未经任何富集处理的情况下检测限分别为1 pmol/L和6 pmol/L,线性范围分别为6 pmol/L ~ 100 nmol/L和30 pmol/L ~ 100 nmol/L。然而,对于实际生物样品例如人血清中靶蛋白的检测,样品中高丰度的基质会严重干扰PCR扩增,而目前常用的核酸样品前处理技术又难以适用于本检测策略。我们利用碱基互补配对原理设计合成了分别与适配体两端引物区结合的互补链,通过凝胶阻滞实验(EMSA)筛选出最佳的互补链,并将优选的生物素化的互补链连接到链霉亲和素磁珠上,以此为探针捕获复杂基质中的PCR扩增模板。研究结果表明,尽管检测灵敏度略有降低,但是应用该前处理方法,可成功地将所建立的检测策略应用到正常人血清中的rHuEPO-α定量检测。第三章则进一步验证了基于磁分离技术的适配体实时定量PCR分析方法的普适性。基于适配体与靶分子之间高效、专一的结合特性,近来适配体在多个领域尤其是分析化学等领域得到了广泛应用,但大都针对单一靶分子而展开检测,普适性的检测方法仍然是基于适配体的分析检测技术所亟需解决的难点。根据第二章中成功建立的基于磁分离技术的适配体实时定量PCR检测策略,本章则分别选取了代表生物大分子的凝血酶和代表有机小分子的ATP作为检测对象,考察上述检测策略的普适性,为建立基于适配体的靶分子通用检测方法奠定基础。研究结果表明,仅需简单优化互补链序列,该基于磁分离技术的适配体实时定量PCR普适型检测策略可成功地对结合缓冲液中添加的凝血酶和ATP的浓度进行准确定量,尤其是针对分子量仅为一个碱基大小的ATP靶分子的检测。第四章建立了基于糖苷酶活性的RIP毒性分析新方法。RIP是一类专一性水解真核或原核生物的核糖体RNA中一个保守的腺苷酸的N-C糖苷键,释放出一个腺嘌呤碱基使核糖体失活,从而抑制蛋白质生物合成的生物毒素。该类蛋白具有极强的细胞毒性,且尚无特效解毒药,因此针对其建立包括定性、定量以及活性分析在内的一整套灵敏、简便的检测方法具有重要现实意义。II型RIP--蓖麻毒素亦是禁止化学武器公约(CWC)附表1清单化学品中唯一的蛋白类毒素,目前本课题组已针对蓖麻毒素已经建立了较为完整的定性、定量分析方法,但尚无法判定蓖麻毒素的活性(毒性)状态。为解决该问题,并进一步完善蓖麻毒素的系统分析,我们基于毒素的糖苷酶活性建立了体外毒性分析方法,以LC-TOF/MS测定脱嘌呤反应中释放出的腺嘌呤的量来确定毒素的活性。我们系统优化了该分析方法的条件,包括液相色谱-质谱条件、脱嘌呤反应中所用的内标、脱氧寡核苷酸底物、反应pH值、温度和时间、保护蛋白的浓度以及反应终止液等。基于上述优化的脱嘌呤反应体系,可准确测定了低至10 ng/mL的活性蓖麻毒素,而经免疫磁珠亲和捕获后检测限可降至1 ng/mL。在特异性考察中发现毒素糖苷酶的体外脱嘌呤反应具有很强的特异性,不仅常见的蛋白酶不影响糖苷键的稳定性,而且肽N-糖苷酶F和β-葡糖醛酸糖苷酶同样不干扰毒素体外脱嘌呤反应。进一步以体外脱嘌呤反应为基础,建立了RIP的毒性分析平台,并应用于包括蓖麻凝集素、蓖麻毒素A链及相思子毒素在内的II型RIP,结果显示该平台实现了毒素毒性的简便、快速、灵敏的分析检测,并且可以满足实际生物样品中毒素活性的快速侦检需求。

全文目录

缩略词表  6-9
中文摘要  9-12
英文摘要  12-16
第一章前言  16-30
  1.1 SELEX 技术与适配体的应用  16-25
    1.1.1 SELEX 筛选技术  16-17
    1.1.2 SELEX 技术的新发展  17-19
      1.1.2.1 non-SELEX  17-18
      1.1.2.2 凝集素导向的亲和树脂SELEX  18
      1.1.2.3 MonoLEX 技术  18-19
    1.1.2 适配体定义与特性  19-20
    1.1.3 适配体在活性蛋白质检测中的应用  20-25
      1.1.3.1 夹心ELISA 法  20
      1.1.3.2 适配体生物传感  20-23
      1.1.3.3 基于适配体的微芯片  23-24
      1.1.3.4 基于适配体可扩增性的蛋白质检测技术  24-25
  1.2 蓖麻毒素  25-29
    1.2.1 蓖麻毒素概述  25-26
    1.2.2 蓖麻毒素的测定方法  26-29
      1.2.2.1 免疫分析法  26-27
      1.2.2.2 基于适配体的检测方法  27
      1.2.2.3 仪器分析法  27-28
      1.2.2.4 蓖麻毒素活性分析  28-29
  1.3 本论文的研究意义、内容与创新点  29-30
第二章基于适配体的实时定量PCR 检测重组人促红细胞生成素  30-52
  2.1 引言  30-32
  2.2 仪器与试剂  32-34
    2.2.1 主要仪器  32-33
    2.2.2 试剂  33-34
  2.3 溶液配制  34-35
  2.4 实验部分  35-37
    2.4.1 凝胶迁移阻滞(EMSA)分析  35-36
    2.4.2 基于策略A 的实时定量PCR 检测rHuEPO-α  36
    2.4.3 策略B 中互补链的优化  36
    2.4.4 基于策略B 的实时定量PCR 检测rHuEPO-α  36-37
  2.5 结果与讨论  37-50
    2.5.1 设计思路与可行性  37-38
    2.5.2 RAS-E 与rHuEPO-α的结合能力  38-39
    2.5.3 策略A 中互补序列的优化  39-40
    2.5.4 PCR 条件的优化及引物特异性  40-41
    2.5.5 基于策略A 的实时定量PCR 检测rHuEPO-α  41-43
    2.5.6 策略B 中互补链的优化  43-44
    2.5.7 基于策略B 的实时定量PCR 检测rHuEPO-α  44-47
    2.5.8 复杂基质中添加的rHuEPO-α的检测  47-50
  2.6 本章小结  50-52
第三章基于磁分离技术的适配体实时定量PCR 检测策略的应用  52-62
  3.1 引言  52-54
  3.2 仪器与试剂  54-55
    3.2.1 主要仪器  54
    3.2.2 试剂  54-55
    3.2.3 溶液配制  55
  3.3 实验部分  55-56
    3.3.1 检测策略中互补链的优化  55-56
    3.3.2 互补链TCS-2/4 的选取  56
    3.3.3 基于磁分离的适配体实时定量PCR 检测靶分子  56
  3.4 结果与讨论  56-61
    3.4.1 互补链的选取  57-58
    3.4.2 互补链TCS-2 和TCS-4 的比较  58-59
    3.4.3 基于磁分离的适配体实时定量PCR 测定凝血酶和ATP  59-61
  3.5 本章小结  61-62
第四章基于糖苷酶活性的核糖体失活蛋白的毒性分析  62-91
  4.1 引言  62-64
  4.2 仪器与试剂  64-65
    4.2.1 主要仪器  64
    4.2.2 试剂  64-65
  4.3 溶液配制  65-66
  4.4 实验部分  66-67
    4.4.1 操作安全性  66
    4.4.2 LC-MS 条件  66
    4.4.3 内标的选择  66
    4.4.4 脱嘌呤反应条件  66
    4.4.5 基于糖苷酶活性的蓖麻毒素定量分析及特异性  66
    4.4.6 LC-MS 测定蓖麻毒素的含量以及活性  66-67
    4.4.7 基于体外脱嘌呤反应的毒素毒性分析平台的建立  67
  4.5 结果与讨论  67-89
    4.5.1 蓖麻毒素毒性分析的意义  67-69
    4.5.2 基于LC/TOF-MS 的腺嘌呤检测方法  69-75
      4.5.2.1 LC 条件  69-71
      4.5.2.2 MS 条件  71-72
      4.5.2.3 内标的选取  72-75
      4.5.2.4 基于LC-TOF/MS 的腺嘌呤标准曲线的绘制  75
    4.5.3 蓖麻毒素脱嘌呤反应条件  75-84
      4.5.3.1 底物序列  75-78
      4.5.3.2 毒素体外脱嘌呤反应参数  78-84
    4.5.4 基于糖苷酶活性分析的蓖麻毒素定量测定  84-87
      4.5.4.1 基于糖苷酶活性的蓖麻毒素测定曲线绘制  84-86
      4.5.4.2 蓖麻毒素糖苷酶活性分析方法的特异性  86-87
    4.5.5 蓖麻毒素两种质谱分析方法的比较  87-88
    4.5.6 基于体外脱嘌呤反应的毒素毒性分析平台  88-89
  4.6 本章小结  89-91
结论  91-93
参考文献  93-103
附录：攻读学位期间发表及参与发表的学术论文目录  103-104
适配体治疗学的研究进展  104-112
  参考文献  108-112
个人简历  112-113
致谢  113

生物活性分子检测新方法的研究

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