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卟啉类衍生物的合成及其抗肿瘤活性的初步研究

作　者: 张会杰
导　师: 刘浩然
学　校: 湖南大学
专　业: 药物化学
关键词: 卟啉基质金属蛋白酶抑制剂噻唑蓝法一氧化氮明胶酶谱
分类号: R914
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

早在上世纪四十年代，科学家们就已经发现，血卟啉能选择性地富集在肿瘤组织。此后经过研究证实，卟啉类化合物都具有在肿瘤细胞中富集的特点，即卟啉类化合物对肿瘤细胞具有靶向定位作用。恶性肿瘤治疗的难点在于肿瘤的转移。在转移过程中，肿瘤细胞不断侵袭周围组织，降解细胞外基质，导致肿瘤的扩散。已有研究表明，基质金属蛋白酶（Martix metaloproteinases，MMPs）在肿瘤组织中经常过度表达，尤其是MMP-2，MMP-9，与肿瘤的转移密切相关，但是大多数基质金属蛋白酶抑制剂（MMPI）由于选择性差，在临床治疗中存在着一些不良反应。依据卟啉类化合物以上特点，我们结合基质金属蛋白酶抑制剂（MMPI）设计原理，设计并合成了七个具有潜在选择性的MMPI，并对其生物活性进行了初步的探讨，以期能够筛选出具有选择性的抗肿瘤转移化合物。本论文包括以下几方面的内容：(1)介绍了卟啉类化合物对肿瘤细胞的定位机理和基质金属蛋白酶抑制剂的结构改造策略，综述了卟啉类抗癌药物及基质金属蛋白酶抑制剂的研究进展。(2)根据药物设计中的药物拼合原理，以卟啉为载体结构，通过在卟啉分子中引入可能的MMPI抑制基团，设计并合成了卟啉-阿魏酸类化合物及含硫卟啉类衍生物，并利用1H NMR，UV，MS，Elemental analysis等手段进行了结构表征。(3)采用MTT法对合成的卟啉化合物与Hela和Bel-7402细胞相互作用进行了初步的研究。研究表明合成的所有卟啉及其衍生物对Hela和Bel-7402细胞的生长均有抑制作用，并且呈现出浓度依赖性。卟啉及其阿魏酸类衍生物中，化合物A2对Hela和Bel-7402细胞的IC50值分别为10.93μmol/L，13.58μmol/L。除此之外，化合物A1、A3、A4、A5的IC50值都在100-150μmol/L之间，在Hela和Bel-7402这两种肿瘤细胞之间的选择性差异不明显；而巯基卟啉类化合物与阿魏酸卟啉类化合物相比，化合物B2、B3、B4抑制这两种肿瘤细胞的IC50值都在100μmol以下，且IC50值大小分别为B1>B2>B3>B4，化合物B4的IC50值分别为43.47μmol/L和40.41μmol/L。(4)运用Griess法测定了化合物对肿瘤细胞释放NO的影响。实验结果表明，随着化合物浓度的升高，肿瘤细胞释放的NO的含量均有不同程度的升高，呈现出一定的浓度依赖性。总体来看，化合物A1和化合物A4促进肿瘤细胞释放NO的能力较强，基本维持在500(mmol/L)/g，其他化合物则维持在100-300(mmol/L)/g左右，化合物促进细胞释放NO的能力在Hela和Bel-7402这两种肿瘤细胞之间大致相同，没有出现特异选择性。（5）通过SDS-PAGE明胶酶谱电泳，考察了卟啉及其阿魏酸衍生物对Hela细胞中明胶酶的抑制作用，实验结果显示，卟啉及其阿魏酸衍生物对分子量为72KD的明胶酶有特异选择性，并且随着化合物浓度的升高，酶的活性逐渐下降。（6）利用高效液相色谱法对巯基卟啉衍生物在人类肝癌细胞（Bel-7402）中的代谢产物做了初步研究。

全文目录

英文缩写词表  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-14
第1章绪论  14-24
  1.1 卟啉类化合物在医药领域的研究进展  14-19
    1.1.1 卟啉类化合物在肿瘤组织中的富集原理  15
    1.1.2 卟啉类光动力学抗癌药物  15-16
    1.1.3 卟啉声动力学治疗癌症药物  16
    1.1.4 卟啉键连抗癌药物的研究进展  16-19
  1.2 基质金属蛋白酶抑制剂研究进展  19-22
    1.2.1 基质金属蛋白酶（Martix metaloproteinases，MMPs）  19-21
    1.2.2 基质金属蛋白酶抑制剂（MMPI）的研究进展  21-22
  1.3 本课题的设计思路、研究内容及研究意义  22-24
    1.3.1 设计思路及创新点  22-23
    1.3.2 研究内容  23
    1.3.3 研究意义  23-24
第2章卟啉类衍生物的设计、合成和表征  24-41
  第一部分卟啉-阿魏酸甲酯衍生物的合成  24-33
    2.1 实验仪器及试剂  25-26
      2.1.1 实验仪器  25
      2.1.2 实验试剂  25-26
    2.2 卟啉-阿魏酸甲酯衍生物的合成  26-31
      2.2.1 卟啉-阿魏酸甲酯的合成路线  26-27
      2.2.2 5-(4-羟基苯基)-10, 15, 20-三苯基卟啉的合成  27
      2.2.3 5, 10, 15, 20-(4-羟基苯基)卟啉的合成  27-28
      2.2.4 4-羟基-3 甲氧基苯丙烯酸甲酯的合成  28
      2.2.5 3-甲氧基-4-溴丁氧基苯丙烯酸甲酯的合成  28-29
      2.2.6 5-(3-甲氧基 4-丁氧基丙烯酸甲酯基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉的合成  29
      2.2.7 5-(3-甲氧基-4-四苯基丁氧基苯丙烯酸甲酯)-10, 15, 20-三羟基苯基卟啉的合成  29-30
      2.2.8 5, 10, 15, 20-(3-甲氧基-4-四苯基丁氧基苯丙烯酸甲酯)苯基卟啉的合成  30-31
    2.3 结果与讨论  31-33
      2.3.1 溴丁氧基阿魏酸甲酯的合成  31-32
      2.3.2 卟啉-阿魏酸甲酯衍生物的合成  32-33
  第二部分巯基卟啉类衍生物的合成  33-41
    2.4 巯基卟啉衍生物的合成  33-38
      2.4.1 5-(4-溴丁氧基)-10, 15, 20-三苯基卟啉的合成  33-34
      2.4.2 5-(4-硫乙酯丁氧基苯基)- 10, 15, 20-三苯基卟啉的合成  34-35
      2.4.3 5-(4-异硫脲丁氧基苯基)-10, 15, 20-三苯基卟啉的合成  35
      2.4.4 5-(4-半胱氨酸丁氧基苯基)-10, 15, 20-三苯基卟啉的合成  35-36
      2.4.5 5-(4-硝基苯基)-l0, 15, 20-三苯基卟啉的合成  36
      2.4.6 5 -(4-氨基苯基)-10, 15, 20-三苯基卟啉的合成  36-37
      2.4.7 5-(4-氯乙酰氨基苯基)-l0, 15, 20-三苯基卟啉的合成  37
      2.4.8 5-(4-乙酰胺硫乙酯基苯基)-l0, 15, 20-三苯基卟啉的合成  37-38
    2.5 结果与讨论  38-41
      2.5.1 5-(4-溴丁氧基)-10, 15, 20-三苯基卟啉的合成  38
      2.5.2 5-(4-异硫脲丁氧基苯基)-10, 15, 20-三苯基卟啉的合成  38
      2.5.3 5-(4-半胱氨酸丁氧基苯基)-10, 15, 20-三苯基卟啉的合成  38-39
      2.5.4 5-(4-硫乙酯丁氧基苯基)-10, 15, 20-三苯基卟啉的合成  39-40
      2.5.5 5-(4-氨基苯基)-10, 15, 20-三苯基卟啉的合成  40-41
第3章卟啉类衍生物的体外抗肿瘤活性的初步研究  41-52
  3.1 引言  41-44
    3.1.1 细胞活性的测定方法  41-43
    3.1.2 卟啉类衍生物的体外细胞活性测试  43-44
  3.2 仪器与试剂  44
    3.2.1 实验仪器  44
    3.2.2 实验试剂  44
    3.2.3 细胞株  44
  3.3 实验方法及步骤  44-45
    3.3.1 实验步骤  44-45
    3.3.2 统计学方法  45
  3.4 结果与讨论  45-52
    3.4.1 卟啉及其阿魏酸衍生物对肿瘤细胞的抑制率  45-48
    3.4.2 巯基卟啉衍生物对肿瘤细胞的抑制率  48-52
第4章 Griess 法测定卟啉衍生物干预的肿瘤细胞 NO 的释放  52-61
  4.1 引言  52
  4.2 实验方法与原理  52-53
    4.2.1 实验方法  52-53
    4.2.2 实验原理  53
  4.3 仪器与试剂  53-54
    4.3.1 试剂  53-54
    4.3.2 细胞株  54
    4.3.3 仪器  54
  4.4 标准曲线的建立  54-56
    4.4.1 溶液的配制  54
    4.4.2 体外 NO 释放标准曲线的绘制  54-55
    4.4.3 蛋白质标准曲线的绘制  55-56
  4.5 统计学方法  56
  4.6 结果与讨论  56-61
    4.6.1 卟啉阿魏酸衍生物对肿瘤细胞释放 NO 的影响  56-58
    4.6.2 巯基卟啉衍生物干预肿瘤细胞 NO 释放的测定  58-61
第5章 SDS-PAGE 凝胶电泳（明胶酶谱法）实验  61-67
  5.1 SDS-PAGE 明胶酶谱电泳法原理  61
  5.2 仪器与试剂  61-62
    5.2.1 实验仪器  61-62
    5.2.2 实验试剂  62
  5.3 方法与步骤  62-64
    5.3.1 溶液的配制  62-63
    5.3.2 工作液的配制  63
    5.3.3 蛋白样品的准备  63-64
    5.3.4 实验步骤  64
  5.4 结果与讨论  64-67
第6章巯基卟啉衍生物在肿瘤细胞中代谢的初步研究  67-73
  6.1 实验方法及原理  67
    6.1.1 实验方法  67
    6.1.2 实验原理  67
  6.2 实验仪器及试剂  67-68
    6.2.1 实验仪器  67
    6.2.2 实验试剂  67-68
    6.2.3 实验细胞株  68
  6.3 实验步骤  68
    6.3.1 待测样品的制备  68
  6.4 结果与讨论  68-73
    6.4.1 对照组 Bel-7402 细胞上清 HPLC 分析  68-69
    6.4.2 化合物 B1及其 Bel-7402 细胞代谢物的 HPLC 分析  69
    6.4.3 化合物 B2及其 Bel-7402 细胞代谢物的 HPLC 分析  69-70
    6.4.4 化合物 B3及其 Bel-7402 细胞代谢物的 HPLC 分析  70-71
    6.4.5 化合物 B4及其 Bel-7402 细胞代谢物的 HPLC 分析  71-73
结论  73-75
参考文献  75-85
致谢  85-86
附录 A 读学位期间所发表的论文目录  86-87
附录 B 化合物核磁氢谱、质谱图  87-96
附录 C 化合物紫外、荧光光谱  96-105

卟啉类衍生物的合成及其抗肿瘤活性的初步研究

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