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黄原胶的发酵和精制研究

作　者: 王桂兰
导　师: 凌沛学
学　校: 山东大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 黄原胶发酵 gumD 透明颤菌血红蛋白基因精制
分类号: R915
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

黄原胶是甘蓝黑腐病黄单胞菌经有氧发酵生产的一种大分子胞外多糖,基本结构是由2个D-葡萄糖、2个D-甘露糖和1个D-葡糖醛酸组成的重复的五糖单元。黄原胶具有优良的稳定性、剪切流变性、增稠性、助悬性和乳化性,被广泛的应用于食品、医药、石油、化工等多个领域,是目前世界上生产规模最大的微生物多糖。我国是黄原胶的主要产地,但黄原胶产率相对较低,高纯度黄原胶的研究还处于空白。本课题立足于工业化角度,以甘蓝黑腐病黄单胞菌Xc58为出发菌株,选用廉价易得的原料,摇瓶中分别对碳源、氮源、无机盐、有机酸进行了单因素的优化,得到最优培养基成分为：土豆淀粉6%,豆饼粉0.40%,碳酸钙0.40%,硫酸镁0.20%,氯化锰0.012%,谷氨酸0.10%。接着,优化发酵条件为：接种量7%,装液量60mL/250mL,温度30℃。优化后黄原胶产量达到27.30g/kg,较优化前产胶量提高24.09%。发酵工艺优化后黄原胶产量仍然较低,尝试对发酵菌株进行基因工程改造,以进一步提高黄原胶发酵产量。通过过量稳定表达gumD基因,得到工程菌株Xc58-D。经10L发酵罐发酵验证,产胶量达到31.21g/kg,比Xc58提高了11.19%,同时也提高了黄原胶的相对分子质量(Mr)和乙酰基含量。但是由于产胶量提高,发酵后期发酵液黏度增大,传质速率低和溶氧不足等问题更加突出,所以又将能够在限氧环境下提高菌体摄氧能力的血红蛋白基因vgb导入Xc58-D中,得到工程菌株Xc58-DV。经摇瓶和10L发酵罐发酵后发现,Xc58-DV在溶氧较差的条件下可以提高黄原胶产量,同时起到了减少通气量、节省成本的作用。本课题还研究了在摇瓶水平发酵培养基中加入表面活性剂和植物油等添加剂,观察其对黄原胶发酵的影响,当发酵初始时加入0.06%Triton X-100,48h时加入0.09%Tween-20,产胶量达到35.22g/kg,比对照组提高了17.87%,当玉米胚芽油添加量为1.17%～1.50%时,产胶量达到34.04g/kg,比对照组提高17.10%。对发酵所得的黄原胶进行了精制工艺的研究。分别对硅藻土、活性炭、醇沉等步骤进行了正交优化设计实验,得到最佳纯化工艺参数：硅藻土型号为DP-20,加入量3%。,温度80℃；碱性蛋白酶加入量50g/1×106g,温度45℃,pH为8；活性炭型号为767型,加入量5‰,温度55℃,pH为6；醇沉温度为50℃,醇用量1.5倍于黄原胶溶液体积,pH为5,醇沉2次。对得到的黄原胶样品进行检测,并与黄原胶药用辅料、玻璃酸钠注射用原料药标准进行比较,各项指标均合格,具备了制备注射用原料药的条件。为后续开发黄原胶注射液,并应用于医学美容、关节腔注射等领域奠定基础。

全文目录

摘要  12-14
ABSTRACT  14-16
主要符号说明  16-17
第一章前言  17-25
  1.1 黄原胶的简介  17-20
    1.1.1 黄原胶的性质  18
    1.1.2 黄原胶的应用  18-19
    1.1.3 黄原胶的生产现状  19-20
  1.2 黄原胶发酵条件优化  20-21
  1.3 黄原胶发酵菌株产胶基因及透明颤菌血红蛋白概述  21-23
  1.4 黄原胶的纯化工艺研究  23-24
  1.5 本课题研究的主要内容  24
  1.6 本课题研究的目的及意义  24-25
第二章黄原胶的发酵生产条件优化  25-40
  2.1 材料  25-26
    2.1.1 菌种  25
    2.1.2 主要仪器  25
    2.1.3 主要试剂  25-26
    2.1.4 培养基  26
  2.2 方法  26-27
    2.2.1 细菌含量测定  26
    2.2.2 发酵液产胶量测定  26
    2.2.3 发酵液黏度测定  26
    2.2.4 单因素法优化培养基  26
    2.2.5 微生物的培养  26
    2.2.6 10L发酵罐中试  26-27
  2.3 结果与讨论  27-39
    2.3.1 菌株基本生长特性  27
    2.3.2 摇瓶发酵条件的优化  27-38
    2.3.3 10L发酵罐中试  38-39
  2.4 本章结语  39-40
第三章黄原胶基因工程菌的构建  40-58
  3.1 材料  40-41
    3.1.1 菌种及质粒  40
    3.1.2 主要仪器  40-41
    3.1.3 主要试剂  41
    3.1.4 培养基  41
  3.2 方法  41-46
    3.2.1 DNA的操作  41-44
    3.2.2 测序  44
    3.2.3 质粒稳定性实验  44-45
    3.2.4 CO差光光谱法检测VHb的表达活性  45
    3.2.5 黏度测定  45
    3.2.6 10L发酵罐发酵  45
    3.2.7 发酵液产胶量测定  45-46
    3.2.8 黄原胶的纯化  46
    3.2.9 黄原胶重均分子量(Mw)与Mw分布  46
    3.2.10 乙酰基及丙酮酸含量测定  46
  3.3 结果  46-57
    3.3.1 gumD导入对黄原胶发酵的影响  46-52
    3.3.2 vgb基因导入对黄原胶发酵的影响  52-54
    3.3.3 Xc58、Xc58-D、Xc58-DV产胶情况摇瓶发酵验证  54-55
    3.3.4 Xc58-D、Xc58-DV 10L发酵罐发酵验证  55-57
  3.4 本章结语  57-58
第四章添加剂对基因工程菌株发酵的影响探索  58-69
  4.1 材料  58-59
    4.1.1 菌种  58
    4.1.2 主要仪器  58
    4.1.3 主要试剂  58
    4.1.4 培养基  58-59
  4.2 方法  59
    4.2.1 细菌含量测定  59
    4.2.2 发酵液产胶量测定  59
    4.2.3 表面活性剂溶液配制  59
    4.2.4 微生物的培养  59
    4.2.5 正交设计验证Tween-20与Triton X-100的协同效果  59
  4.3 结果与讨论  59-67
    4.3.1 表面活性剂的加入对菌种产胶的影响  59-65
    4.3.2 添加植物油对黄原胶发酵的影响  65-67
  4.4 本章结语  67-69
第五章注射用黄原胶原料药的精制研究  69-84
  5.1 材料  69-70
    5.1.1 主要仪器  69
    5.1.2 主要试剂  69-70
  5.2 方法  70-71
    5.2.1 制备工艺条件单因素考察  70
    5.2.2 黄原胶的含量测定  70
    5.2.3 黄原胶蛋白质含量测定  70-71
    5.2.4 黄原胶相对分子质量(Mw)与Mw分布  71
    5.2.5 黄原胶原料药质量检查方法  71
    5.2.6 黄原胶pH值与异丙醇残留量  71
    5.2.7 铅含量  71
    5.2.8 初步稳定性观察  71
  5.3 结果与讨论  71-82
    5.3.1 硅藻土应用条件优化  71-73
    5.3.2 酶加入条件的优化  73-74
    5.3.3 活性炭应用条件优化  74-76
    5.3.4 醇沉条件的优化  76-78
    5.3.5 注射用黄原胶原料药最佳制备工艺  78-79
    5.3.6 注射用黄原胶原料药质量标准考察  79-82
  5.4 本章结语  82-84
总结  84-86
参考文献  86-91
致谢  91-93
攻读学位期间发表的学术论文目录  93-94
学位论文评阅及答辩情况表  94

黄原胶的发酵和精制研究

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