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模拟失重大鼠动脉平滑肌细胞凋亡与增殖的变化及间断性人工重力的影响

作　者: 蔡越
导　师: 马进; 谢满江; 任新玲
学　校: 第四军医大学
专　业: 航空航天与航海医学
关键词: 微重力航天飞行后心血管失调血管平滑肌细胞凋亡对抗措施间断性人工重力胸主动脉腹主动脉颈总动脉股动脉免疫组织化学方法 Western blot分析 TUNEL染色 M30染色血小板源性生长因子及其受体血管内皮生长因子血管重建
分类号: R85
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

航天飞行与地面卧床实验结果均提示，航天员在失重环境停留时间愈长，返回地面后，以立位耐力不良和运动能力下降为标志的心血管功能失调就愈严重。有关立位耐力不良发生机理的研究工作表明，其发生涉及多重机制：首要因素是全身血容量的减少，还包括下肢静脉系统顺应性降低，前庭功能改变和心血管系统结构功能改变等。近年来人体实验和动物实验相关研究工作均提示，动脉系统结构功能的差异性区域性重建可能在立位耐力不良的发生中发挥重要作用。国内外已有的工作表明在上半身或者前半身，机体动脉血管持续处于较1G直立体位相对升高的高血压状态，动脉发生肥厚性变化，血管管壁及中膜增厚，平滑肌细胞层数增多，大脑动脉的肌源性紧张度增强，动脉的收缩反应性增强；而在下半身或者后半身，机体动脉血管处于较1G直立体位相对降低的低血压状态，血管中膜萎缩，管壁变薄，动脉的肌源性紧张度减弱，动脉的收缩反应性亦减弱。我们实验室前期工作发现：血管平滑肌离子通道机制与血管组织局部肾素-血管紧张素系统可能是介导模拟失重所致血管区域性特异性适应变化的重要调节环节。目前，航天飞行活动中，已经发现运动为主的对抗措施并不能完全有效预防长时间航天飞行所致的立位耐力不良的发生，要保证长期航天任务的完成，需要发展新的对抗措施。我们在地面动物实验研究结果表明：每日短时（1h）-GX重力（恢复站立体位），模拟间断性人工重力（intermittentartificial gravity，IAG），能很好的防止模拟失重致心血管结构功能改变。短期（3天）和中期（28天）模拟失重实验结果表明：1h/d的-GX可有效防止模拟失重大鼠动脉系统（包括弹力型大动脉和中、小肌型动脉）结构和功能的变化，有效防止管壁肥厚性或萎缩性改变与防止中小动脉肌源性紧张度和收缩反应性的改变。因此，IAG可能是将来长期航天飞行中一种理想的对抗措施。截至目前，对模拟失重及间断性人工重力对抗所致动脉系统结构和功能的改变的具体机制仍不完全清楚，值得进一步研究。增殖、分化与凋亡是组织器官细胞数量保持相对恒定的基本要素，在模拟失重状态下动脉系统的区域性特异性重建以及间断性人工重力对抗所致动脉系统结构功能的改变是否与细胞的增殖和凋亡相关，以及具体的机理和调控机制皆不清楚，相关方面的研究工作亦未见报道。本工作采用国际通用的“尾部悬吊大鼠模型”观察了模拟失重大鼠动脉系统平滑肌细胞凋亡与增殖的变化情况，以及1h/d恢复正常站立体位模拟IAG对动脉系统血管平滑肌细胞凋亡与增殖的影响。实验中用TUNEL染色和M30染色方法观察凋亡事件的发生，用免疫组织化学和蛋白免疫印迹分析方法研究动脉血管组织中凋亡与增殖相关蛋白Caspase3、Fasl、Bad、Bcl-2和PCNA的表达与定位，并检测了PDGFA、PDGFRA和VEGF等生长因子的表达。本工作的主要发现如下：第一部分21天模拟失重可致大鼠前/后身动脉血管平滑肌细胞凋亡状态发生区域特异性的改变模拟失重21天后，与对照组（CON）比较，悬吊组（SUS）大鼠颈总动脉和股动脉血管平滑肌细胞M30染色阳性细胞分别减少和增多；SUS大鼠股动脉血管平滑肌细胞TUNEL染色阳性细胞数增多，胸主动脉血管平滑肌细胞TUNEL染色阳性细胞率减少(P <0.05)；SUS大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞凋亡相关蛋白Caspase3(P <0.01)、Bad (P <0.01)和Fasl (P <0.05)的表达减少，Bcl-2和PCNA的表达增加（P <0.05）；而腹主动脉血管平滑肌细胞凋亡相关蛋白Caspase3（P <0.05）、Fasl（P <0.05）和Bad的表达增多，Bcl-2（P <0.05）与PCNA（P <0.01）的表达减少。综上所述，模拟失重21天后，大鼠前半身动脉血管组织平滑肌细胞凋亡减少，增殖增加；后半身动脉血管组织平滑肌细胞凋亡增多，增殖减少。第二部分21天模拟失重可致大鼠前/后身动脉血管组织PDGFA、PDGFRA和VEGF的表达发生区域特异性适应改变采用Western-blot分析方法，检测了21天模拟失重大鼠前/后身动脉血管组织PDGFA、PDGFRA和VEGF的表达。与CON比较，SUS大鼠胸主动脉血管组织PDGFA（P <0.01）、PDGFRA（P <0.01）和VEGF（P <0.05）的表达增强；腹主动脉血管组织PDGFA、PDGFRA和VEGF的表达减弱（P<0.01）。综上，模拟失重致动脉系统血管组织局部生长因子的表达发生区域特异性变化。第三部分每日1h站立对抗可加重或减轻模拟失重大鼠前/后身动脉血管组织平滑肌细胞的凋亡。每日1h站立能够防止模拟失重大鼠前半身动脉发生肥厚性变化，后半身动脉发生萎缩性变化。与CON及SUS比较，站立对抗组（STD）大鼠颈总动脉血管平滑肌细胞M30染色阳性细胞数增多，较CON，STD股动脉血管平滑肌细胞M30染色阳性增多，而较SUS，STD股动脉血管平滑肌细胞M30染色阳性减少；TUNEL染色结果显示STD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞TUNEL染色阳性细胞率增多（P <0.05, vs CON; P <0.01, vs SUS；STD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞凋亡相关蛋白Caspase3、Bad和Fasl的表达较CON与SUS分别增加（P <0.01），Bcl-2的表达较CON有增多趋势，较SUS减少，但没有统计学意义。PCNA的表达较CON与SUS分别增加（P <0.01）与（P <0.05）；STD大鼠腹主动脉血管平滑肌细胞凋亡相关蛋白Caspase3、Fasl和Bad的表达较CON增加，较SUS减少，但没有统计学差异， Bcl-2的表达较CON与SUS分别增加（P <0.05）与（P<0.01），PCNA的表达较SUS增加（P <0.01），但较CON增加不明显。说明STD大鼠胸主动脉血管组织平滑肌细胞凋亡与增殖较CON与SUS均明显增多，发生剧烈重建；而STD大鼠腹主动脉血管平滑肌细胞凋亡较SUS减少，增殖较SUS增加。第四部分每日1h站立对抗可导致模拟失重大鼠前/后身动脉血管组织PDGFA、PDGFRA和VEGF的表达皆升高与CON和SUS比较，每日1h正常体位站立对抗模拟失重大鼠胸主动脉血管组织PDGFA、PDGFRA和VEGF的表达均增多（P <0.01）；STD大鼠腹主动脉血管组织PDGFA、PDGFRA和VEGF的表达较SUS增多（P<0.01），较CON，VEGF的表达增加（P <0.05），而PDGFA和PDGFRA的表达仅有增多趋势。说明生长因子在每日1h站立对抗过程中发挥重要作用。综上所述，中期模拟失重大鼠胸主动脉与腹主动脉血管平滑肌细胞凋亡分别减少与增多，同期每日1h正常体位站立对抗能分别防止模拟失重大鼠胸主动脉与腹主动脉血管平滑肌细胞凋亡的减少与增多，阻止模拟失重致动脉系统结构功能的区域特异性适应性改变，但是加剧了胸主动脉血管平滑肌细胞的凋亡与增殖。说明血管平滑肌细胞的凋亡与增殖在模拟失重及IAG致动脉系统结构功能的区域特异性适应改变中发挥重要作用；中期（21天）模拟失重大鼠胸主动脉与腹主脉血管局部组织PDGFA、PDGFRA和VEGF的表达分别上调与下调，同期每日1h正常体位站立对抗可导致模拟失重大鼠胸主动脉与腹主动脉血管局部组织PDGFA、PDGFRA和VEGF的表达均上调，表明动脉血管局部组织PDGFA、PDGFRA和VEGF表达的变化，亦可能在模拟失重及IAG致动脉系统结构功能重塑过程中发挥重要作用。

全文目录

缩略语表  5-7
中文摘要  7-12
Abstract  12-19
前言  19-23
文献回顾  23-38
  一、动脉系统在航天飞行（微重力）后的区域性特异性适应改变  23-25
  二、人工重力对失重不利影响的对抗效果  25-27
  三、血管平滑肌细胞凋亡及其调控  27-38
引言  38-39
1. 材料  39-44
  1.1 模拟失重大鼠模型  39
  1.2 实验设计  39-40
  1.3 抗体和试剂  40-44
2.方法  44-52
  2.1 血管组织学标本的制备  44-45
  2.2 TUNEL 法  45-46
  2.3 M30 检测  46-47
  2.4 免疫组织化学染色  47-48
  2.5 Western-blot 分析蛋白的表达  48-52
  2.6 图像分析及数据统计  52
3 结果  52-66
  3.1 实验动物一般情况  52
  3.2 M30 检测结果  52-55
  3.3 TUNEL 检测结果  55-57
  3.4 血管的免疫组织化学染色结果  57-60
  3.5 蛋白免疫印迹分析  60-66
4 讨论  66-73
小结  73-77
参考文献  77-88
附录  88-89
个人简历和研究成果  89-91
致谢  91

模拟失重大鼠动脉平滑肌细胞凋亡与增殖的变化及间断性人工重力的影响

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