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小鼠骨髓间充质干细胞悬液短期保存的可行性及DNA酶Ⅰ预处理降低静脉注射风险性研究

作　者: 时炳正
导　师: 杜晓岩; 金岩; 施松涛
学　校: 佳木斯大学
专　业: 口腔医学
关键词: 骨髓间充质干细胞悬液细胞鉴定 4℃保存 DNA酶Ⅰ 注射风险性
分类号: R781.05
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：本研究为前期本实验室将异体同种骨髓间充质干细胞（Bone marrowmesenchymal stem cells BMSCs）悬液经山羊颈静脉注射致急性肺栓塞发生故设计探索性的实验，目的在于比较4℃恒温条件下短期保存对小鼠骨髓间充质干细胞（C57-BMSCs）的细胞活性及生物学特性是否产生影响，为短期安全有效的保存BMSCs提供参考，探索使用DNA酶Ⅰ（DeoxyribonucleaseⅠ DNaseⅠ）预处理后的注射用BMSCs经尾静脉注射至同种异体小鼠体内的移植方式，能够起到降低直接血管内移植导致发生急性肺栓塞的风险。为将来在临床或口腔组织工程领域应用提供安全性参考。方法：（1）体外无菌分离培养纯化C57-BMSCs，鉴定BMSCs的骨向、脂向分化能力，经流式对其的表面分子标志物表达程度检测。（2）磷酸盐的缓冲液（PhosphateBuffered Saline PBS）作为C57-BMSCs的短期储存液，直接将BMSCs置于4℃恒温保存，存储0h、4h、12h、24h及48h后取试样，镜检细胞、测算统计活细胞比例、比较增殖和分化能力。（3）对正常C57-BMSCs和DNaseⅠ预处理后C57-BMSCs悬液细胞聚集状态及体外增殖、分化能力进行比较。（4）将体外分离、培养、纯化后的C57-BMSCs扩增至第三代。将C57小鼠随机分为四组：注射PBS组（n=30）、注射10U/mlDNaseⅠ-PBS组（n=30）、注射正常C57-BMSCs组（n=30）、注射DNaseⅠ预处理后C57-BMSCs组（n=30）。（5）注射PBS组与注射正常C57-BMSCs组每只小鼠以5ml/kg的比例，分别经尾静脉注射相应剂量的PBS或本实验室前期试验摸索得到（3×106cell）的临界致死剂量C57-BMSCs，取急性死亡小鼠脏器做组织学检测，注射PBS组做对照，观察记录并统计急性死亡率。（6）注射DNaseⅠ预处理后C57-BMSCs组，每只小鼠按5ml/kg比例注射DNaseⅠ预处理后3×106个C57-BMSCs观察急性死亡率。结果：（1）于4℃恒温条件下短期保存C57-BMSCs4h、12h和24h后取样镜下观察见良好的形态、活细胞占80%左右，细胞增殖、分化能力上相比于0h无统计学意义（P>0.05）；48h取样后镜下见悉数视野的死细胞和细胞碎片、仅20%左右为活细胞，与0h相比细胞增殖、分化能力上存显著性差异（P<0.05）。（2）DNaseⅠ预处理不影响C57-BMSCs增殖、分化能力（P>0.05）；DNaseⅠ预处理C57-BMSCs与正常C57-BMSCs相比细胞聚集成团比例显著降低（P<0.05）。（3）与注射PBS组相比，注射正常C57-BMSCs组的急性死亡率是60%、组织学检测发现心肺异常并且肺血管内有异染物质，诱发了急性肺栓塞。（4）注射DNaseⅠ预处理后C57-BMSCs组的急性死亡率降为23.3%，与注射正常C57-BMSCs组相比有统计学差异（P<0.05）。结论：（1）4℃恒温条件下24h内短期保存C57-BMSCs为一种简单易行的保存方法。但是，细胞生物学特性与活性随保存时间延长是呈逐渐下降的，并直至丧失。（2）DNaseⅠ预处理不影响C57-BMSCs的生物学特性,DNaseⅠ能够降低经静脉注射移植C57-BMSCs悬液中单个细胞间聚集所诱发急性肺栓塞风险的发生。为将来临床或口腔组织工程领域的应用提供了一定的安全性参考。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-11
文献综述  11-16
实验 1：C57-BMSCs 的体外分离、培养、鉴定  16-19
  一、实验设备仪器与相关试剂  16-17
  二、实验动物  17
  三、实验方法  17-18
  四、结果  18-19
实验 2: 4℃条件下 C57-BMSCs 于 PBS 中短期保存对细胞活性和生物学特性的影响  19-25
  一、实验设备仪器与相关试剂  19-21
  二、实验动物  21
  三、实验方法  21-23
  四、结果  23-25
实验 3：DNA 酶Ⅰ预处理不影响注射用细胞悬液中 BMSCs 的体外增殖、分化能力并抑制悬液中单个细胞间的聚集  25-28
  一、实验设备仪器与相关试剂  25-26
  二、实验动物  26
  三、实验方法  26-27
  四、结果  27-28
实验 4：DNA 酶Ⅰ对注射用 C57-BMSCs 预处理降低经静脉注射细胞发生急性肺栓塞的风险  28-33
  一、实验设备仪器与相关试剂  28-29
  二、实验动物  29
  三、实验方法  29-31
  四、结果  31-33
结果  33-34
讨论  34-38
结论  38-39
参考文献  39-45
致谢  45-46
英文缩写  46-47
攻读学位期间发表的论文  47-48
附图  48-54

小鼠骨髓间充质干细胞悬液短期保存的可行性及DNA酶Ⅰ预处理降低静脉注射风险性研究

内容摘要

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