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塞来昔布和氨芬酸对血管内皮生长因子诱导下恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞作用的比较及机制的研究

作　者: 梁泽玉
导　师: 陈松
学　校: 天津医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 恒河猴视网膜脉络膜内皮细胞 脉络膜新生血管 塞来昔布 氨芬酸 曲安奈德 药物治疗
分类号: R774.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：本研究通过测定塞来昔布(Celecoxib)、氨芬酸(Amfenac)及曲安奈德(Triamcinolone acetonideon)对VEGF165诱导RF/6A细胞的增殖抑制率及细胞划痕修复实验、细胞分裂周期、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)分泌量及环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2) mRNA. VEGF受体-2(VEGF receptor-2, KDR) mRNA、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)mRNA、基质金属蛋白酶组织抑制剂-2、-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-2、-3, TIMP-2、TIMP-3) mRNA的相对表达量的影响,研究并比较上述药物对RF/6A细胞增殖及迁移行为的抑制作用差异及机制。方法：本研究分为正常对照组、VEGF165作用组、VEGF165+Celecoxib组、VEGF165+Amfenac组、VEGF165+TA组,每组设6个复孔,实验重复测量3次,取平均值。1、RF/6A单细胞悬液(细胞数约1×104/m1)接种至96孔细胞培养板培养24h后,弃上清；用仅含有终浓度为25ng/ml的VEGF165及VEGF165联合三种药物IC50浓度的培养基培养细胞24h、48h、72h分别行MTT实验测定细胞增殖抑制率。弃20μl培养液后,于测试前4h每孔加入等量MTT (5mg/ml)孵育4h,终止培养；弃液加入DMSO150μl,振荡5min,使紫色结晶完全溶解,于酶标仪测定570nm处吸光值A,计算细胞增殖抑制率并推算药物的IC50值。细胞抑制率=1-实验组A值/对照组A值2、将RF/6A细胞以1×106/ml密度接种于六孔细胞培养板内,进行细胞划痕修复实验。利用无菌10μltip枪头在孔中央对细胞作一条约0.8mm的划痕,更换正常或含有相应药物的培养基,温箱培育48h后观察划痕两侧的细胞间距离变化(μm),低倍镜下(×40)拍照,利用Image Pro-Plus图像处理软件测量“裸区”面积,利用Image J图像处理器分析“裸区”像素前后改变,测定三种药物对VEGF165诱导下细胞迁移能力的影响。3、将不同处理组的细胞消化后调整细胞数量>1×105/ml的单细胞悬液,离心后,70%乙醇固定,4℃放置过夜,加入RNA酶,浓度为50μg/ml,37℃水浴30min,加入PI染液并使最终浓度为100μg/ml,避光30minDNA染色,利用流式细胞仪测定三种药物对正常及VEGF165诱导下RF/6A细胞分裂周期的影响。4、酶联免疫吸附法测定三种药物对VEGF165诱导下RF/6A细胞PGE2的分泌量的影响：按照比例稀释原倍标准品,设立空白孔调零后,450nm波长依次测量各孔吸光度OD值,利用标准品与吸光度之间的回归方程,测量相应吸光度OD值对应的含量。5、实时荧光定量PCR (RT-PCR)法检测三种药物对VEGF165诱导下RF/6A细胞COX-2mRNA、KDRmRNA、 MMP-2mRNA、 TIMP-2mRNA、 TIMP-3mRNA的相对表达量差异：采用trizol法提取RNA、比较阈值法测定mRNA的相对表达量。统计方法：计量资料采用均数±标准差；组间比较采用独立样本t检验及单因素方差分析；组内两两比较采用Dunnett t检验及LSD检验；相关性分析采用pearson相关性分析,P<0.05为差异具有显著性。结果1、celecoxib对正常RF/6A细胞增殖的抑制率及ICso值测定celecoxib作用于正常RF/6A细胞24h、48h、72h组的吸光度A值经差异行组间单因素方差分析显示差异具有显著性(F=4.76、3.88、4.29,P<0.05),Dunnett检验对照组与各浓度组的吸光度A值差异,除24h及72h两组内0.01μm/l差异无显著性(T=2.34、1.89,p>0.05),其余组间差异具有显著性；对照组及不同浓度组吸光度A值经单因素方差分析显示,除对照组差异无显著性(F=1.29,p>0.05),其余浓度组差异均有统计学意义,行LSD检验显示,0.1及0.01μm/l浓度组的48h与72h的吸光度A值差别无统计学差异(q=3.04、3.33,p>0.05),其余浓度组内不同时间点差异均有统计学差异(P<0.05)。吸光度A值随时间增加而增加,具有时间依赖性。选择48h为后续实验的观察点,药物的IC50值为17.33μm/1。2、 Amfenac对正常RF/6A细胞增殖的抑制率及ICso值测定Amfenac作用正常RF/6A细胞24h、48h、72h组的吸光度A值经差异行组间单因素方差分析显示差异具有显著性(F=3.98、4.62、4.01,P<0.05),Dunnet t检验各浓度组的吸光度A值差异显示,除72h组内0.1μm/l、0.01μm/l的吸光度A值与对照组差异无显著性(T=2.02,p>0.05),其余相同组间不同浓度吸光度A值差异具有显著性；对照组及不同浓度组吸光度A值经单因素方差分析显示,对照组差异无显著性(F=2.12,p>0.05),其余浓度组差异均有统计学意义,行LSD检验显示,除0.01μm/l浓度组内48h与72h的吸光度A值差别无统计学差异(q=4.42,p>0.05),其余各浓度组内不同时间组差异均有统计学差异(P<0.05)。吸光度A值随时间增加而增加,具有时间依赖性。选择48h为后续实验的观察点,药物的IC50值为17.33μm/1。3、 Celecoxib及Amfenac不同浓度的细胞抑制率比较：抑制率48h细胞抑制率经独立样本t检验显示,差值均有统计学意义(p<0.05),48h时间点Amfenac对RF/6A细胞的抑制率较Celecoxib明显。4、48h Celecoxib、Amfenac及TA对VEGF165诱导RF/6A细胞的吸光度A值及细胞抑制率比较不同实验组的吸光度A值经单因素方差分析表明差异具有显著性(F=65.62,p=0.000)。各实验组与对照组的吸光度A值差异行Dunnett t检验显示,差异具有显著性(p<0.05),VEGF165组吸光度A值高于对照组；不同实验组抑制率行单因素方差分析显示差异具有显著性(F=69.38,p=0.000),行LSD检验显示三组药物对细胞的抑制率均有差异(p=0.000、0.000、0.019)。5、 Celecoxib、 Amfenac及TA对细胞划痕修复实验比较对细胞划痕修复实验前后“裸区”面积变化像素差异行单因素方差分析显示组间差异具有显著性(F=536.427,p=0.000)：行Dunnett t检验差异具有显著性,其中VEGF165组像素值高于对照组(p=0.011)；实验组行LSD检验行组间两两比较差异具有显著性(p=0.000、0.001、0.000),其中VEGF165+Celecoxib组的像素降低最为明显,其次为VEGF165+TA组及VEGF165+Amfenac组。6、Celecoxib、 Amfenac及TA对正常及VEGF165诱导RF/6A细胞周期的影响Celecoxib、 Amfenac及TA对正常RF/6A细胞分裂周期G1、S期所占细胞周期比例经单因素方差分析显示差异具有显著性(F=107.613、1156.981,P=0.000、0.000)；Dunnett t检验显示实验组与各对照组细胞所占百分比差异具有显著性(p=0.001、0.000)；行LSD检验进行组间两两比较显示,除Celecoxib组与TA组对G1期、S期所占细胞周期比例差异无显著性(p=0.143),其余组均具有统计学意义。Celecoxib、 Amfenac及TA对VEGF165诱导RF/6A细胞分裂周期G1、S期所占细胞周期比例经单因素方差分析显示差异具有显著性(P<0.05);Dunnett t检验显示各实验组与对照组细胞所占百分比差异具有显著性(p=0.001、0.000)；行LSD检验进行组间两两比较显示,除Celecoxib组与TA组对G1期、S期所占细胞周期比例差异无显著性(p=0.630),其余组均具有统计学意义。7、 Celecoxib、 Amfenac及TA对VEGF165诱导下RF/6A细胞PGE2分泌量的影响经对数曲线回归分析得出样品与吸光度之间的回归方程：样品量=-45.478+424.557吸光度；回归模型经单因素方差检验,具有统计学意义(F=3008.818,p=0.000),R=0.994；R2=0.987,显示曲线拟合良好。对不同处理组中RF/6A细胞PGE2表达量行单因素方差分析差异具有显著性(p<0.05)；VEGF165组与实验组行Dunnett t检验比较显示,与对照组的表达量差异具有显著性(p=0.000、0.000、0.000),VEGF165可诱导RF/6A细胞的PGE2表达量较各实验组增加；各实验PGE2表达量差异行LSD检验显示差异具有显著性(p<0.05),VEGF165+Celecoxib组PGE2表达量低于VEGF165+Amfenac组及VEGF165+TA组(p=0.034、0.011)。8, RT-PCR法测定药物作用于VEGF165诱导下的细胞表达COX-2、KDR、MMP-2、TIMP-2、 TIMP-3mRNA相对表达量琼脂糖凝胶电泳鉴定结果：各组样本均可见28S和18S两个清晰条带,28S/18S比值约为2：1,提示提取的RNA比较完整,未见明显降解。组间各因子mRNA的相对表达量行单因素方差分析显示差异具有显著性；各实验组与VEGF165组相对表达量差异行Dunnuet t检验显示,除VEGF165组诱导细胞KDRmRNA的相对表达量与VEGF165+Amfenac及VEGF165+TA组无统计学差异(P=0.655、0.459),其余因子的相对表达量与VEGF165组的差异均具有显著性(p<0.05);实验组各因子mRNA表达量行LSD检验VEGF165+Celecoxib与VEGF165+Amfenac两组间COX-2mRNA的相对表达量差异无显著性、VEGF165+Amfenac与VEGF165+TA两组MMP-2、TIMP-2、 TIMP-3、 KDRmRNA的相对表达量差异无显著性(p>0.05),其余两两组间各因子的相对表达量差异均有统计学意义(p<0.05)。PGE2表达量与COX-2mRNA行pearson线性相关性分析,结果显示二者成明显正相关(R=0.851,p<0.01)；MMP-2、TIMP-2、 TIMP-3mRNA的相对表达量与COX-2mRNA的相对表达量行pearson线性相关性分析表明上述三因子分别与COX-2具有明显正相关(R=0.806、0.892、0.897,p<0.01)。各实验组MMP-2mRNA:TIMP-2mRNA比值行单因素方差分析显示实验组间比值差异具有显著性(F=6.838,P=0.013)；行LSD检验行表明VEGF165+Celecoxib组的比值低于其余组别(P=0.045、0.003、0.008)。KDRmRNA与细胞迁移前后“裸区”面积变化像素值行pearson相关性分析显示二者具有明显正相关性(R=0.544,p=0.031)结论1. Celecoxib、 Amfenac及TA可抑制VEGF165诱导的RF/6A细胞增殖,其机制为增加G1期、降低S期所占细胞周期比重,Amfenac的抑制作用强于Celecoxib及TA。2. Celecoxib、 Amfenac及TA可抑制VEGF165诱导的RF/6A细胞迁移,但抑制机制不同。 Celecoxib通过抑制COX-2-PGE2-MMPs系统、降低MMP-2：TIMP-2比值及KDRmRNA的相对表达量抑制细胞迁移,Amfenac及TA通过抑制COX-2-PGE2-MMPs系统抑制细胞迁移,Celecoxib作用强于Amfenac及TA。

全文目录


中文摘要  4-9
Abstract  9-15
缩略语  15-16
前言  16-19
  研究现状、成果  16-17
  研究目的、方法  17-18
  本研究主要内容  18-19
对象和方法  19-29
  1 实验对象  19
  2 实验材料  19-22
    2.1 主要试剂  19-20
    2.2 主要仪器  20
    2.3 主要试剂的配置  20-22
  3 实验方法  22-29
    3.1 细胞培养  22-23
      3.1.1 细胞复苏  22-23
      3.1.2 细胞传代  23
      3.1.3 细胞悬液的配置  23
    3.2 MTT法检测Celecoxib及Amfenac对RF/6A细胞的抑制率及IC #50值测定  23
      3.2.1 实验方法  23
      3.2.2 实验分组  23
    3.3 VEGF_(165)诱导细胞增殖  23-24
    3.4 细胞划痕模型的建立  24
    3.5 流式细胞仪测定细胞停留分裂周期比例  24
    3.6 药物对VEGF_(165)诱导下细胞分泌PGE2  24
    3.7 RT-PCR法测定药物作用VEGF_(165)诱导下的细胞表达各因子的测定  24-29
实验结果  29-47
  1 Celecoxib不同浓度及时间作用下对RF/6A细胞的抑制及IG_(50)测定  29-30
    1.1 Celecoxib不同药物浓度作用下不同时间点的吸光度A值统计学分析  29
    1.2 Celecoxib对细胞生长抑制率及IC_(50)的测定  29-30
  2 Amfenac不同浓度及时间作用下对RF/6A细胞的抑制及IC_(50)测定  30-32
    2.1 吸光度A值及统计学分析  30-31
    2.2 Amfenac对细胞生长的抑制率及IC_(50)的测定  31-32
  3 Celecoxib与Amfenac 48h抑制率的比较  32
  4 4 8h Celecoxib、Amfenac及TA对VEGF_(165)诱导RF/6A细胞的吸光度A值及细胞抑制率比较  32-34
  5 细胞划痕修复实验数据及统计分析  34-35
    5.1 细胞划痕修复实验图  34
    5.2 细胞迁移像素差异统计学分析  34-35
  6 流式细胞仪测量细胞周期  35-39
    6.1 不同组细胞周期图  35-37
    6.2 Celecoxib,Amfenac及TA对RF/6A细胞各周期统计学分析  37-38
    6.3 Celecoxib、Amfenac及TA对VEGF_(165)诱导RF/6A细胞各周期的统计分析  38-39
  7 各组PGE_2分泌量及统计学分析  39-41
  8 RT-PCR法测定药物作用于VEGF_(165)诱导下的细胞表达各因子mRNA含量及统计学分析  41-47
    8.1 RF/6A细胞表达mRNA含量计算  41-42
    8.2 各实验组RF/6A细胞表达各因子mRNA相对表达量统计学分析  42-47
讨论  47-56
  1 Celecoxib、Amfenac及TA抑制RF/6A细胞的研究背景及对象的选择  47
  2 Celecoxib、Amfenac及TA对正常RF/6A细胞增殖的抑制作用  47-48
  3 VEGF_(165)对NV形成的作用及三种药物对VEGF_(165)诱导RF/6A细胞增殖及细胞周期的抑制作用比较  48-49
  4 三种药物对VEGF_(165)诱导RF/6A细胞迁移能力的抑制作用比较及机制的研究  49-50
  5 三种药物对VEGF_(165 )诱导RF/6A细胞表达MMPs-TIMPs系统及COX-2-PGE2系统的作用  50-54
  6 三种药物对VEGF_(16 5)诱导RF/6 A细胞KDR表达的作用比较  54-56
结论  56-57
参考文献  57-65
发表论文和参加科研情况说明  65-66
综述  66-76
  综述参考文献  71-76
致谢  76

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