学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

CUEDC2功能研究的相关基础工作

作　者: 王玉博
导　师: 张学敏
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: CUEDC2 表达定位稳定细胞系
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 38次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

本实验室发现CUEDC2能够通过促进孕激素受体PR的泛素化降解从而抑制PR的转录活性,进而抑制乳腺癌细胞的生长,此外,它还能够作为蛋白磷酸酶1(PP1)的关键介导子,抑制NF-?B信号通路的激活。然而其详细的生物学功能还未阐释,通过生物信息学分析发现,CUEDC2包含一个非常小的中度保守结构域——CUE结构域,包含大约40个氨基酸,预测它够与泛素结合,既能识别单泛素化又能识别多泛素化,目前发现它存在于多种真核蛋白质中。近期研究我们发现CUEDC2在有丝分裂(M期)可以发生磷酸化,这可能与CUEDC2的功能密切相关。为了明确CUEDC2在M期的功能,首先,利用分子生物学的方法建立CUE结构域缺失突变体△CUE和110位突变体S110E和S110A(分别模拟磷酸化和非磷酸化)。第二,将多种CUEDC2突变体构建到带有RFP标签的载体上,并且利用细胞同步化的方法将Hela细胞同步化在M期,以明确CUEDC2在M期的定位。第三,利用分子生物学方法将多种突变体构建到原核和昆虫表达载体上,摸索表达和纯化的方法最终获得CUEDC2多种突变体蛋白,为CUEDC2功能研究的相关实验做好准备。最后,利用逆转录病毒包装系统在NIH3T3细胞中建立CUEDC2多种突变体稳定表达的细胞系,为明确CUEDC2的转化成瘤能力做好准备。定位与功能息息相关,故CUEDC2的定位对于其功能的研究是非常重要的。利用细胞同步化的方法将Hela细胞同步化至M期,以标准和温和的两种固定方法固定,分别用两个不同克隆号的CUEDC2的抗体去孵育,在内源水平上明确CUEDC2在M期的定位,此外将带有RFP标签的CUEDC2的突变体转染至Hela细胞中利用同样的同步化和固定方法,进一步研究外源CUEDC2在M期可能的定位,发现它可能在中心体和中体上有特异性定位,而这样的定位并不依赖于110位的磷酸化和CUE结构域,这些结果提示CUEDC2可能在M期发挥一定的功能。原核系统的表达方法具有应用广泛、容易获得、方法简单、时间短、易纯化、成本低等优势,但是对于具有一些修饰的蛋白功能的研究不具有优势,而真核表达系统弥补了这一缺陷。杆状病毒昆虫表达系统是常用真核表达系统之一,是蛋白结构和功能研究的发展趋势。为了进一步研究的需要,将CUEDC2的多种突变体克隆至原核和昆虫表达载体中去,并摸索其表达和纯化的方法。根据人CUEDC2序列设计引物,以其突变体质粒为模板PCR扩增目的片段,酶切后连接至pET28a原核表达载体以及pFastBac1-Flag-N和pFastBac-HTA昆虫表达系统的表达载体,转化至DH5α后提取质粒,经菌液PCR、测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)及DH10Bac感受态细胞中。原核表达载体在E.coli中表达后用Ni-NTA亲和纯化,SDS-PAGE检测。昆虫表达载体提取杆粒,转染至昆虫细胞Sf9中表达并初步摸索纯化的条件方法。利用磷酸钙转染HEK293T细胞的方法包装逆转录病毒并感染NIH3T3,建立了非融合表达GFP的CUEDC2多种突变体的稳定表达细胞系。经过流式细胞术分选GFP阳性的细胞和Western Blot检测,最终确定细胞系建立成功,这为研究CUEDC2是否具有转化成瘤能力做好了准备。

CUEDC2功能研究的相关基础工作

内容摘要

全文目录

相似论文