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Twistl对人乳腺癌细胞E-cadherin表达及成血管能力的影响

作　者: 张冲
导　师: 孙保存
学　校: 天津医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 乳腺癌血管生成拟态 Twistl E-cadherin 上皮-间充质转变
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究目的乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一,虽然通过规范化治疗,早期乳腺癌患者五年生存率达到98%,但是,与40年前相比,转移性乳腺癌患者5年生存率只从20%提高至26%,患者多死于转移,故研究乳腺癌的转移机制具有重要意义。Twist是一种常染色体上的bHLH(basic helix-loop-helix)类型的转录因子,研究发现Twist在抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤细胞侵袭、转移过程中起重要作用。本研究利用人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231进行细胞转染调控其Twist1的表达,从而探讨转录调控因子Twist1对人乳腺癌细胞上皮钙粘蛋白(epithelial cadherin, E-cadherin)表达的影响,及对人乳腺癌细胞迁移、侵袭和成血管塑形能力的影响。方法1.根据Twist1表达水平,选取人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231,37℃、5%CO2恒温培养箱常规培养。2.低表达Twist1的MCF-7细胞转染上调Twist1表达质粒pcDNA3-Twist1获得Twist1上调模型,高表达Twist1的MDA-MB-231细胞转染下调Twist1表达质粒pGP-Twist1-shRNA获得Twist1下调模型,利用Western Blot和逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)分别从蛋白水平和mRNA水平鉴定转染效果；3.利用RT-PCR检测MCF-7细胞上调Twist1和MDA-MB-231细胞下调Twist1后E-cadherin在mRNA水平表达的变化；4.利用细胞免疫荧光检测MCF-7细胞上调Twist1和MDA-MB-231细胞下调Twist1后E-cadherin表达及亚细胞定位的变化；5.利用划痕实验观察乳腺癌细胞MCF-7上调Twist1和MDA-MB-231下调Twist1后细胞迁移能力的变化；6. Transwell实验评价乳腺癌细胞MCF-7上调Twist1和MDA-MB-231下调Twist1后细胞侵袭能力的变化；7.进一步利用Matrigel三维培养模型分析Twist1对人乳腺癌细胞管道化塑性能力的影响。结果1.根据RT-PCR和Western Blot结果显示,在mRNA和蛋白水平,pcDNA3-Twist1均能明显上调MCF-7细胞的Twist1表达,pGP-Twistl-shRNA可以有效下调MDA-MB-231细胞内Twist1表达,并且细胞形态也出现相应变化；2.根据RT-PCR结果显示,上调Twist1后MCF-7细胞E-cadherin表达下降,免疫荧光显示其膜表达消失,亚细胞定位发生改变；下调Twist1后MDA-MB-231细胞E-cadherin表达增多。3.根据划痕实验、Transwell实验结果,对上调Twistl的MCF-7细胞和下调Twist1的MDA-MB-231细胞进行对比分析表明：上调Twist1可以促进人乳腺癌细胞MCF-7的迁移运动和侵袭能力,下调Twist1可以降低人乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭能力,P<0.05,有统计学意义。4.根据三维培养结果,对上调Twist1的MCF-7细胞和下调Twist1的MDA-MB-231细胞进行对比分析表明：三维培养条件下,上调Twist1可以促进MCF-7细胞形成管腔样结构,下调Twist1可抑制MDA-MB-231细胞形成管腔样结构。结论1.作为EMT关键调控基因,Twist1表达上调能抑制恶性度低的乳腺癌细胞E-cadherin的表达,并增强其迁移、侵袭及血管生成能力,Twist1表达下调能增强恶性度高的乳腺癌细胞E-cadherin的表达,并抑制其迁移、侵袭及血管生成能力。2. Twist1及其调控的E-cadherin是影响乳腺癌细胞高侵袭能力的关键分子。3. Twist1能诱导人乳腺癌细胞产生EMT,并且促进VM形成。4. Twistl和E-cadherin是调控乳腺癌VM形成的重要蛋白,可以作为其诊断标志物,并且Twist1和E-cadherin也有望成为抑制乳腺癌血管生成的治疗靶点。

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