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Hedgehog信号通路对胰腺癌耐药的影响及其调节机制

作　者: 安勇
导　师: 苗毅
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: 胰腺癌 Hedgehog信号通路 MAP3K10 DYRK2 耐药性吉西他滨
分类号: R735.9
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景：吉西他滨化疗仍然是胰腺癌综合治疗中最主要的方法，然而令人遗憾的是，吉西他滨在带给胰腺癌患者化疗毒副作用的同时，却没能显著的改善病人的治疗效果，究其原因，主要是胰腺癌对吉西他滨的天然性和（或）获得性的耐受。Hedgehog（HH）信号通路被认为是胰腺癌的“核心”信号通路。HH信号通路抑制剂可以提高胰腺癌对吉西他滨的敏感性，能够改善胰腺癌的天然性耐药，但是关于HH信号对胰腺癌获得性耐药的影响目前尚无报道。SMO是HH通路中的一个关键信号转导元件，I期试验研究结果显示SMO抑制剂对58%的进展期基底细胞癌患者有效果，但对纳入研究的9个胰腺癌病人均无明显效果，提示HH信号通路在胰腺癌中的作用机制更为复杂，探索HH通路新的调节机制及靶点十分重要。目的：1、研究人胰腺癌吉西他滨耐药细胞株中HH信号通路元件的表达情况，并探讨抑制HH信号通路能否逆转胰腺癌细胞对吉西他滨的获得性耐药。2、研究MAP3K10在胰腺癌组织中的表达情况，探讨MAP3K10对胰腺癌细胞吉西他滨敏感性的影响及其对HH信号通路的调节作用。3、研究DYRK2在胰腺癌组织中的表达情况，探讨DYRK2对胰腺癌细胞吉西他滨敏感性的影响及其对HH信号通路的调节作用。方法：1、建立人胰腺癌吉西他滨耐药细胞株SW1990/GR，荧光定量PCR及Western blot检测SW1990/GR细胞中HH通路元件SMO及Gli-1的表达；以环王巴明（HH信号通路抑制剂）处理SW1990/GR细胞，荧光定量PCR及Western blot比较处理前后SMO及Gli-1的表达差异；联用环王巴明与吉西他滨处理SW1990/GR，Annexin V与PI双染检测细胞凋亡。2、荧光定量PCR、western-blot及免疫组织化学检测26对胰腺癌与癌旁组织及6例正常胰腺组织中MAP3K10的表达情况。构建MAP3K10过表达/干扰质粒，转染胰腺癌细胞。MTT及EdU法检测转染前后细胞增殖能力的变化；流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化；Transwell实验检测转染前后细胞侵袭能力的变化；流式细胞仪检测细胞凋亡分析转染前后细胞对吉西他滨敏感性的变化；荧光定量PCR及Western-blot检测转染前后HH通路元件（Gli-1/2）及DYRK2、GSK3β在细胞中的变化。3、荧光定量PCR、western-blot及免疫组织化学检测26对胰腺癌与癌旁组织及6例正常胰腺组织中DYRK2的表达情况。构建DYRK2过表达/干扰质粒，转染胰腺癌细胞。MTT及集落形成实验检测转染前后细胞增殖能力的变化；流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化；流式细胞仪检测细胞凋亡分析转染前后细胞对吉西他滨敏感性的变化；荧光定量PCR及Western-blot检测转染前后Gli-2、c-Jun、c-Myc和Cyclin-E在细胞中的变化。结果：1、与人胰腺癌细胞株SW1990相比，耐药细胞株SW1990/GR中SMO及Gli-1表达增高；环王巴明可以降低耐药株SW1990/GR中SMO及Gli-1的表达水平，使细胞在吉西他滨作用下凋亡率升高。2、26对组织中，胰腺癌组织MAP3K10表达高于相应癌旁组织的有21对。与对照组相比，MAP3K10过表达组细胞增殖能力增强、处于G2+S期细胞比例增多、对吉西他滨敏感性下降，而细胞侵袭能力没有明显变化。定量PCR及Western-blot检测结果示：MAP3K10过表达能够下调DYRK2和GSK3β的mRNA和蛋白水平，上调Gli-1和Gli-2的mRNA和蛋白的水平；MAP3K10干扰能够上调DYRK2和GSK3β的mRNA和蛋白水平，下调Gli-1和Gli-2的mRNA和蛋白的水平。3、26对组织中，胰腺癌组织DYRK2表达低于相应癌旁组织的有22对。与对照组相比，DYRK2过表达组细胞增殖能力及集落生成能力降低、处于G2+S期细胞比例减少、对吉西他滨敏感性升高。PCR及Western-blot检测结果示：DYRK2过表达能够下调Gli-2的mRNA水平和蛋白水平，DYRK2干扰能够上调Gli-2的mRNA水平和蛋白水平；过表达DYRK2对c-Jun、c-Myc和Cyclin-E的mRNA水平没有影响，而干扰DYRK2对c-Jun和c-Myc的mRNA水平没有影响，但可以升高Cyclin-E的mRNA水平；过表达DYRK2对细胞中c-Jun、c-Myc和Cyclin-E的蛋白水平没有影响，而干扰DYRK2可以使细胞中c-Jun、c-Myc和Cyclin-E蛋白水平升高。结论：1、抑制HH通路能够逆转胰腺癌对吉西他滨的获得性耐受。2、MAP3K10能够促进胰腺癌细胞增殖并降低对吉西他滨的敏感性，其作用机制可能是通过上调HH信号通路。3、DYRK2能够抑制胰腺癌细胞增殖并提高对吉西他滨的敏感性，对Gli-2、c-Jun、c-Myc和Cyclin-E的调节是其主要作用机制。

全文目录

中文摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
前言  11-17
第一部分抑制 Hedgehog 信号通路能够逆转人胰腺癌细胞获得性耐药  17-40
  材料和方法  17-30
  结果  30-37
  讨论  37-40
第二部分 MAP3K10 上调 Hedgehog 通路促进胰腺癌细胞增殖和化疗耐受  40-72
  材料和方法  40-59
  结果  59-70
  讨论  70-72
第三部分 DYRK2 下调 Hedgehog 通路抑制胰腺癌细胞增殖和化疗耐受  72-90
  材料和方法  72-76
  结果  76-87
  讨论  87-90
参考文献  90-104
全文小结  104-107
综述  107-127
  参考文献  119-127
中英文对照及缩略词表  127-131
攻读学位期间发表文章情况  131-133
致谢  133

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