学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

ACNP-MET纳米药物递送系统及其对肝癌干细胞靶向性研究

作　者: 孙岚
导　师: 张英鸽
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 纳米药物递送系统二甲双胍 CD133 人肝癌Huh-7细胞
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 59次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

目的：制备特定粒径范围的活性炭纳米粒子（activated carbon nanoparticles,ACNP）与二甲双胍（metformin，MET）构建ACNP-MET纳米药物递送系统，探讨ACNP-MET对CD133⁺人肝癌Huh-7细胞的靶向作用。方法：采用球磨悬浮沉淀法制备ACNP-MET纳米药物递送系统载体ACNP；通过激光粒度分析仪、透射电镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）对其粒径和形态进行表征；用光学显微镜（LM）和TEM观察ACNP对体外细胞形态的影响；采用乳酸脱氢酶（LDH）和组织病理学检查评价ACNP对细胞膜的影响；将一定配比的ACNP与MET超声混悬吸附，观测不同时间点未被吸附的MET的量，以吸附曲线达最高不再上升点所对应的时间作为吸附达平衡时间；将不同配比的ACNP和MET混悬液吸附达平衡后，测未被吸附的MET的量，通过等温吸附公式确定ACNP与MET的最佳配比；采用流式细胞分选技术从人肝癌细胞系Huh-7中分选出CD133⁺细胞，并进行干细胞比例分析；通过对CD133⁺细胞体外成球能力及增殖能力检测，评价CD133⁺细胞的自我更新能力；观察在非肥胖性糖尿病/重度联合免疫缺陷小鼠（NOD/SCID）体内成瘤情况，评价CD133⁺细胞的致瘤性；采用细胞增殖/毒性检测试剂盒（CCK-8）法研究ACNP-MET对体外培养CD133⁺细胞的生长抑制作用；采用流式细胞术（FCM）测定ACNP-MET对Huh-7细胞中CD133⁺细胞比例的影响，初步评价ACNP-MET对CD133⁺细胞的靶向作用；用光学显微镜观察ACNP-MET对CD133⁺细胞的成球率的影响；应用“微肿瘤”模型评价ACNP-MET对肿瘤干细胞的敏感性。结果：球磨悬浮沉淀法制备的ACNP颗粒大小均匀、形状规则、近似球状、表面光滑，平均粒径为188nm。光镜下观察发现ACNP对细胞有很好的亲和性，细胞生长状态良好；电镜下观察,细胞轮廓明显，核膜完整，核内常染色质均匀分散，核仁大而清晰，与对照组比较未见异常。不同浓度的ACNP作用不同时间，细胞LDH漏出量与对照组相比均无显著性差异（P>0.05）。ACNP腹腔注射后3个月解剖小鼠，腹腔内未见水肿、渗出和粘连等炎症反应；病理组织学检查腹壁及腹膜组织间隙、腹膜淋巴样组织、腹腔淋巴结及淋巴样组织内有大量的ACNP，但其周围组织未见炎症细胞浸润、渗出和水肿；电镜下观察，淋巴细胞的细胞核内有ACNP，但是细胞及亚细胞结构依然正常。ACNP静脉注射后20天及6个月，观察小鼠心、肝、脾、肺和肾组织的病理切片发现，在上述组织中的ACNP周围均未见组织粘连，水肿，渗出等病理现象，脑组织中也未见ACNP。紫外可见分光光度计全波长扫描结果显示，MET在233nm波长处有最大吸收峰，而阴性对照溶液无干扰。故选择233nm为测定波长。在1～10μg/ml范围内，MET的吸光度A与其浓度C呈直线正相关。以吸光度A对浓度C线性回归得标准曲线方程为：A=0.00479+0.08137C（r²=0.9995，P<0.01）。在25℃时，4h左右ACNP吸附MET达到平衡状态，且随着时间的延长吸附量不再发生明显变化；室温条件下，所得等温方程式为C/X=-0.00531+0.00399C（r²=0.995，P<0.01），ACNP对MET的饱和吸附量Xm=256.17mg/g。1g ACNP吸附256.17mg MET达到饱和。故ACNP-MET中MET与ACNP质量比为1：4。利用流式细胞术富集Huh-7细胞中CD133⁺细胞，分选前的CD133⁺细胞的百分比为6.08%，分选后再次测试所得细胞中CD133⁺细胞的百分比为92.81%，统计学分析表明，分选前后有显著差异（P﹤0.05）。CD133⁺细胞体外无血清培养3d即可成球且生长速度较CD133-细胞快。1×10⁴CD133⁺细胞在NOD/SCID小鼠体内21d左右即可形成异种移植瘤，测量其体积分别为57.43mm³、57.21mm³、52.51mm³和53.66mm³；光镜下观察小鼠腋下肿块病理组织切片可见，该组织有完整的肿瘤包膜，巨大的肿瘤细胞核，核仁可见，异型性明显，坏死后残存的细胞核碎片呈黑色点状，内部形成坏死区；而1×10⁴CD133-细胞却无一（0/8）成瘤。在体外增殖抑制实验中，含有相同剂量的ACNP-MET组与MET相比，ACNP-MET对CD133⁺及CD133-细胞均有明显增殖抑制作用，呈剂量依赖性，各组之间的统计学结果P值大都维持在0.001以下。MET及ACNP-MET对CD133-细胞的IC₅₀分别为2.514×104和316.997μg/ml；MET及ACNP-MET对CD133⁺细胞的IC₅₀分别为64.509和2.847μg/ml，表明二者对CD133⁺细胞的抑制率明显大于对CD133-细胞的抑制率。ACNP组对CD133⁺及CD133-细胞的抑制率最大不超过6%左右；与含有相同剂量的ACNP组相比ACNP-MET与MET组对CD133⁺及CD133-细胞的抑制率具有显著性差异（P<0.01）。通过FCM分析，MET对CD133⁺肝癌Huh-7有抑制作用，但ACNP-MET对其作用更强，统计学分析具有显著性差异（P<0.01），呈剂量依赖性。在成瘤率实验中，200μg/ml的MET组与空白对照组和ACNP组比较，能减少CD133⁺细胞所成球数；在50～200μg/ml浓度范围内, ACNP-MET对CD133⁺细胞体外成球能力的抑制作用呈剂量依赖性，与MET组相比，统计学分析差异具有显著性（P<0.01）。结论：本实验室通过球磨悬浮沉淀法制备出的ACNP与市售的相比，颗粒小且均匀，质量可控，可批量生产；活性炭有良好的生物安全性，纳米化后的ACNP依然具有良好的生物安全性；以CD133为表面标记的流式分选法，可以分选出具有强自我更新能力、增殖能力和致瘤性的肝癌Huh-7干细胞；本研究构建的ACNP-MET，MET与ACNP最佳混合吸附配比为1：4，吸附时间为4h，对MET的最大吸附量为256.17mg/g；MET作为一种用于降低血糖的“老药”可以抑制肝癌干细胞的生长和增殖；含有相同剂量MET的ACNP-MET对CD133⁺及CD133-肝癌Huh-7细胞的抑制作用均好于MET；ACNP本身没有杀伤CD133⁺及CD133-细胞的作用，但ACNP可以显著的增强MET对肝癌干细胞的靶向性和抑制性。ACNP与MET构建的药物递送系统对肝癌干细胞具有良好的靶向性，且ACNP-MET无需与其他化疗药连用即可增强MET对肿瘤干细胞的靶向作用。

全文目录

目录  4-6
英文缩写词表  6-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-13
前言  13-17
  参考文献  15-17
第一部分纳米药物载体—活性炭纳米粒的生物相容性  17-31
  1 引言  17-18
  2 材料与方法  18-20
  3 结果  20-28
  4 讨论  28-30
  5 参考文献  30-31
第二部分 ACNP-MET 纳米药物递送系统的构建  31-39
  1 引言  31-32
  2 材料与方法  32-33
  3 结果  33-36
  4 讨论  36-37
  5 参考文献  37-39
第三部分人肝癌细胞系 Huh-7 中 CD133+细胞的分离及鉴定  39-51
  1 引言  39-40
  2 材料与方法  40-42
  3 结果  42-46
  4 讨论  46-49
  5 参考文献  49-51
第四部分 ACNP-MET 纳米药物递送系统对肝癌干细胞的体外靶向作用  51-66
  1 引言  51-52
  2 材料与方法  52-54
  3 结果  54-61
  4 讨论  61-64
  5 参考文献  64-66
总讨论  66-70
结论  70-72
综述  72-85
  参考文献  81-85
个人简历  85-86
致谢  86

ACNP-MET纳米药物递送系统及其对肝癌干细胞靶向性研究

内容摘要

全文目录

相似论文