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Hsa-miR-486-5p抑制肝癌细胞增殖及侵袭的作用及机制研究

作　者: 孙慧燕
导　师: 王立生
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: hsa-miR-486-5p 肝细胞癌增殖迁移 CITRON CLDN10
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是发病率和病死率较高的恶性肿瘤之一。尽管手术和肝移植是首选的治疗策略，但其适应症范围有限。化疗药物和靶向药物能有效杀伤肝癌细胞，但存在副作用和耐药性问题。因此，进一步阐明肝癌的发病机制，寻找HCC早期诊断指标和药物新靶点是这个领域一亟待解决的医学课题。MicroRNA（miR）具有转录后调控作用，在包括癌症等的病理生理学过程中发挥着重要作用。Hsa-miR-486-5p在胎肝中首先克隆，但其在肝细胞癌（HCC）中有何作用未有报道。本论文将阐明hsa-miR-486-5p在HCC的作用及初步探讨其机制。为发掘HCC早期诊断指标和药物新靶点提供实验基础。本课题首先检测了hsa-miR-486-5p、miR-17-92等microRNAs在HCC细胞系、组织、血清的表达水平；检测了hsa-miR-486-5p的宿主基因Ank1在HCC癌组织及癌旁组织的表达。其次，构建及鉴定hsa-miR-486-5p等microRNA的慢病毒载体，包装并纯化hsa-miR-486-5p等相关慢病毒。利用慢病毒感染HCC细胞系，进行体外实验，检测hsa-miR-486-5p等microRNA在HCC的增殖、凋亡、周期、迁移中的作用；继而从体内阐明hsa-miR-486-5p在HCC的增殖、侵袭、转移中的作用。最后利用microRNA预测网站筛选与HCC细胞生物学特性相关的靶基因，构建并鉴定靶基因3’UTR荧光素酶报告载体，应用双荧光素酶报告实验验证与靶基因的相互作用；设计并合成靶基因siRNA，敲减靶基因模拟hsa-miR-486-5p的抑制靶基因作用，检测靶基因siRNA对HCC的作用，从靶基因水平探讨hsa-miR-486-5p在HCC的作用机制。一、肝癌细胞microRNAs表达研究。我们利用microRNAarray芯片检测了不同细胞株microRNAs的表达差异；利用qRT-PCR的方法检测了hsa-miR-486-5p等在肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、97L、97H、LM3的表达；检测了HCC患者癌组织及癌旁组织中hsa-miR-486-5p及其宿主基因Ank1的表达；检测了HCC患者及普通体检人群血清中hsa-miR-486-5p的表达。MicroRNAarray芯片结果显示LM3相对于SMMC-7721细胞，表达升高2倍以上的microRNA有84个，其中包括hsa-miR-486-5p、hsa-miR-106b-93-25等。肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、97L、97H、LM3相对于肝癌癌旁组织，hsa-miR-486-5p表达明显下降。hsa-miR-106b-93-25在SMMC-7721、97L、97H、LM3各细胞系表达有差异。hsa-miR-155在几种肝癌细胞表达没有差异。hsa-miR-486-5p在大部分HCC患者的癌组织都表达下调，并且hsa-miR-486-5p的宿主基因Ank1也表达下降。hsa-miR-106b-93-25、hsa-miR-17-92及hsa-miR-155在HCC的癌组织和相对应癌旁组织中表达没有明显规律。HCC患者血清中hsa-miR-486-5p的表达低于普通健康体检人员血清的表达水平。根据这部分结果我们得出如下结论：hsa-miR-486-5p在HCC细胞、组织及血清中表达下调；其宿主基因Ank1在HCC组织中也表达下降。其他几种microRNAs的表达没有明显规律。二、hsa-miR-486-5p抑制肝癌细胞增殖及侵袭。我们利用分子克隆的方法将hsa-miR-486-5p构建于pHIV7慢病毒载体并鉴定。应用第二代慢病毒包装系统包装并纯化病毒，利用流式细胞仪和GFP标志测定慢病毒滴度。之后，利用慢病毒感染和流式分选的方式获得稳定过表达和低表达的肝癌细胞株。利用转基因细胞，应用Dye670及CCK-8检测hsa-miR-486-5p等对HCC细胞增殖的影响；应用平板克隆形成方法检测hsa-miR-486-5p对HCC细胞克隆形成能力的影响；应用AVNIX和PI双标法检测hsa-miR-486-5p对HCC细胞凋亡的影响；应用划痕和迁移的方法检测hsa-miR-486-5p等对HCC细胞迁移的影响；应用Western blot和免疫共聚焦的方法检测hsa-miR-486-5p对HCC细胞表皮Marker变化的影响；利用裸鼠荷瘤动物模型及病理分析检测hsa-miR-486-5p在体内对HCC的影响。结果显示成功获得hsa-miR-486-5p及相应对照载体等慢病毒，滴度测定显示5×107pfu/ml以上，可用于后续功能实验。用Dye670染料法证实hsa-miR-486-5p可抑制HCC细胞的增殖，但CCK-8法检测仅有抑制增殖趋势，无统计学差异。克隆形成实验证实hsa-miR-486-5p抑制HCC细胞克隆形成。应用Annexin V和PI双标法检测到hsa-miR-486-5p对HCC细胞凋亡有促进作用，能增加化疗药索拉非尼的敏感性。划痕实验证实hsa-miR-486-5p能抑制HCC细胞划痕的愈合。Transwell迁移实验证实hsa-miR-486-5p能在体外抑制HCC细胞迁移。Western blot和免疫共聚焦的方法结果显示hsa-miR-486-5p可以使SMMC-7721细胞表皮上皮Marker如E-cadherin等表达增强，而使间质Marker如vimentin等表达减弱。利用裸鼠荷瘤模型和病理切片分析，hsa-miR-486-5p在体内延长成瘤时间，对肿瘤的生长的抑制没有统计学意义。抑制肿瘤的转移不明显。根据这部分结果我们得出如下结论：hsa-miR-486-5p抑制肝癌细胞增殖和迁移生物学特性。三、hsa-miR-486-5p在肝癌细胞中的靶基因及作用机制研究。我们利用蛋白芯片方法检测hsa-miR-486-5p过表达后的基因表达差异；利用靶基因预测网站分析与HCC细胞生物学改变相关的靶基因；利用分子克隆方法构建靶基因3′UTR荧光素酶报告载体并鉴定，之后进行双荧光素酶报告基因检测方法筛选hsa-miR-486-5p的相关靶基因；利用siRNA干涉方法检测靶基因CITRON（CIT）和CLDN10对HCC生物学特性的影响。本文利用prism5对所有实验数据进行统计分析。蛋白芯片检测结果与靶基因预测网站提供信息交集，显示差异基因为：IR10RA、STAT6、APP、GRIP1、ESR2、CXADR。利用Targetscan等预测网站分析CIT、CLDN10、TWF1、AFF3、PLAGL2、SRF、DCBLD2等为相关靶基因；成功构建靶基因3′UTR荧光素酶报告载体，用双荧光素酶报告实验验证预测靶基因CIT、CLDN10、TWF1、AFF3可与hsa-miR-486-5p结合。分析上述各基因已报道的功能，并用mRNA表达水平进一步筛选靶基因。最后选定CIT和CLDN10。用小RNA干扰的方法证实CIT表达下调后（模拟hsa-miR-486-5p的作用）HCC细胞增殖能力减弱。用小RNA干扰的方法证实CLDN10表达下调后（模拟hsa-miR-486-5p的作用）HCC细胞迁移能力减弱。根据这部分结果我们得出如下结论：hsa-miR-486-5p通过抑制CIT的表达而抑制HCC细胞增殖；过抑制CLDN10的表达而抑制HCC细胞迁移。总之，本课题首次阐明hsa-miR-486-5p在HCC中表达下调；其抑制HCC细胞增殖和迁移；hsa-miR-486-5p作为一个HCC抑癌基因，其靶基因为CIT和CLDN10。本课题更深入地阐明了HCC的发病机制，同时研究了hsa-miR-486-5p的一个新功能。

全文目录

英文缩略词表  6-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-14
前言  14-18
第一章肝癌细胞 microRNAs 表达研究  18-34
  1．实验材料  18-19
  2．实验方法  19-23
  3．实验结果  23-30
  4．讨论  30-34
第二章 Hsa-miR-486-5p 抑制肝癌细胞增殖及侵袭  34-62
  1．实验材料  34-36
  2．实验方法  36-40
  3．实验结果  40-58
  4．讨论  58-62
第三章 Hsa-miR-486-5p 在肝癌细胞中的靶基因及作用机制  62-76
  1．实验材料  62-63
  2．实验方法  63-66
  3．实验结果  66-74
  4．讨论  74-76
总结  76-78
参考文献  78-82
文献综述  82-92
  参考文献  87-92
个人简历  92-94
  基本情况  92
  学习经历  92
  工作经历  92
  获奖情况  92
  博士期间发表文章  92-93
  Reviewer 经历  93-94
致谢  94

Hsa-miR-486-5p抑制肝癌细胞增殖及侵袭的作用及机制研究

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