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结直肠癌变相关基因表达谱的研究

作　者: 史小雨
导　师: 程书钧
学　校: 北京协和医学院
专　业: 肿瘤学
关键词: 肠发育结直肠癌变 mRNA表达谱结直肠癌结直肠正常黏膜基因共表达网络保守基因簇潜在调控基因结直肠腺瘤 miRNA表达谱调控网络预后
分类号: R735.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究表明胚胎发育与肿瘤发生在组织、细胞及分子水平有很多相似之处。因此,可以借助胚胎发育来研究肿瘤,为探索肿瘤发生发展机制提供新的线索。本部分研究通过检测人肠发育过程3个时间点(妊娠早期胎肠6例、妊娠中期胎肠8例、正常成人肠12例)和结直肠癌变3个阶段(正常成人肠12例、低级别腺瘤71例、高级别腺瘤33例、腺癌47例)组织的mRNA表达谱,分别分析发育和癌变过程基因表达特征,进而对两个过程的数据进行整合分析。结果显示,肠发育过程中表达上调的基因主要参与免疫应答、抗原递呈、离子转运、细胞稳态、细胞凋亡等生物学过程,表达下调的基因主要参与DNA复制、染色质组装、DNA和RNA代谢、细胞粘附、细胞组织形态发生和组织器官发育等生物学过程。结直肠癌变过程中表达上调的基因主要参与转录调控、胚胎形态发生、细胞外基质组织结构、血管生成、细胞粘附、细胞增殖等过程；表达下调的基因主要参与免疫应答、免疫细胞激活、防御反应、炎症反应、细胞离子稳态等过程。肠发育和癌变相关基因表达谱整合分析显示,结直肠肿瘤的基因表达特征与胎肠组织相似,且随着肿瘤的进展,其分子表达谱越接近胎肠发育的早期阶段,可见发育过程和癌变过程的mRNA表达具有动态联系。基于上述肠发育和结直肠癌变的分子特征,进一步筛选出两组表达趋势相反的基因簇,一簇基因在肠发育过程中表达逐渐升高而在癌变过程中表达逐渐降低,主要与免疫应答和细胞凋亡相关；另一簇基因在肠发育过程中表达逐渐降低而在癌变过程中表达逐渐升高,主要与细胞增殖相关。本部分研究结果提示,人肠发育过程与结直肠癌变过程相关mRNA表达谱具有相似性,结直肠癌变过程相关的分子事件可能是胚胎肠发育相关分子事件的再激活或再抑制。以肠发育为切入点,整合分析肠发育与结直肠癌变的内在联系,为结直肠肿瘤的研究提供了新的思路。肿瘤细胞形态和行为等方面的异质性是由(表观)遗传学改变的持续积累所导致的,还是由肿瘤起始细胞在早期阶段就已经建立的固有特征所决定的,仍然是一个有争议的问题。多年前,有研究者提出人类肿瘤的生物先决论假说,认为肿瘤细胞的生物学潜能在癌前阶段就已经决定。本部分研究的目的就是为了探索在肿瘤起始阶段发生的异常分子事件是否可以影响结直肠癌的进展。本部分研究采用mRNA表达谱芯片和miRNA表达谱芯片分别对结直肠正常黏膜、低级别腺瘤、高级别腺瘤和腺癌组织进行了分析。结果显示,与低级别腺瘤转变为高级别腺瘤、直至腺癌的过程相比,mRNA和miRNA的表达在正常肠上皮发展为低级别腺瘤的阶段发生了更大的改变,包括2,322个差异表达mRNAs和71个差异表达miRNAs。利用这些早期的分子变化,我们构建了一个miRNA-mRNA相互作用网络,包括30个miRNA及其调控的166个靶基因。在这些基因中,由5个miRNA调控的55个基因组成的标志物,在三组独立数据集中均与结直肠癌患者的总生存时间或无病生存时间相关。因此,从正常肠上皮转化为上皮内瘤变的阶段中,转录组水平上的分子改变可能会影响结直肠癌的进展。本部分研究通过对人结直肠正常黏膜组织及腺癌组织的基因表达谱分析,挑选出差异表达基因对,构建结直肠正常黏膜和腺癌组织中特异表达的基因簇,为揭示结直肠癌发生发展的分子机理提供新的线索。研究采用mRNA表达谱芯片,对12例正常结直肠黏膜、21例低级别腺瘤、30例高级别腺瘤和25例结直肠癌组织进行了分析。生物信息学分析筛选出结直肠癌变各阶段特异的共表达基因对,并利用正常黏膜和腺癌两个阶段的数据,构建并筛选出分别在正常结直肠组织和癌组织中特异表达的子网络/基因簇,即保守基因簇。正常黏膜相关保守基因簇的功能包括免疫细胞激活、补体激活和器官形态发生等；腺癌相关保守基因簇的功能包括细胞增殖、细胞运动和细胞粘附等。进一步预测每个保守基因簇上游潜在的调控基因,并挑选3个保守基因簇(1个正常相关和2个腺癌相关保守基因簇)中的11个基因及8个预测的调控基因在上述起始样本(12例正常和22例腺癌组织)及独立样本(13例正常和19例腺癌组织)中使用实时定量PCR的方法对其表达水平进行验证。结果显示,19个基因在起始样本和独立样本中差异表达的阳性率分别为84.21%(16/19)和42.11%(8/19)。此外,在细胞中外源过表达MAFB引起cluster16中基因(RAB31, MY05A, WIPF1和LCP1)的mRNA表达水平上调。因此,我们基于基因共表达关系构建、筛选结直肠癌变相关分子网络的方法是可行的,得到的保守基因簇可能对揭示结直肠癌变的分子机制提供线索。

全文目录

目录  3-7
图表索引  7-10
中英语缩略词  10-12
摘要  12-14
ABSTRACT  14-17
第一章导论(含文献综述)  17-26
  一、结直肠癌的概述  18-20
  二、胚胎发育与肿瘤发生的相关性研究  20-21
  三、结直肠癌相关分子网络的系统生物学研究  21-22
  四、肿瘤发生发展的早期决定假说  22-23
  五、肠道的免疫调节及稳态维持  23-25
  六、本课题的研究目的和研究策略  25-26
第二章人肠发育与结直肠癌变相关基因表达谱的整合研究  26-50
  一、结果  26-45
    1、人肠发育过程中mRNA表达模式  26-31
      1.1 人肠发育过程中3个不同时间点组织mRNA表达谱  26
      1.2 人肠发育过程中不同时间点组织mRNA表达特征  26-31
    2、结直肠癌变过程中mRNA表达模式  31-37
      2.1 结直肠癌变过程中4个不同时间点组织mRNA表达谱  31
      2.2 结直肠癌变过程中4个不同时间点组织mRNA表达的动态特征.  31-37
    3、肠发育与结直肠癌变相关mRNA表达谱的整合分析  37-45
      3.1 肠发育过程与结直肠癌变过程相关mRNA表达谱的整体分布概况  37-38
      3.2 不同肠发育时间点组织间差异表达基因在结直肠腺瘤、腺癌中的表达情况  38-40
      3.3 肠发育过程中差异表达基因在结直肠腺瘤、腺癌中的表达趋势  40-41
      3.4 筛选在肠发育过程与结直肠癌变过程中表达趋势相反的基因群  41-45
  二、讨论  45-49
    1、人肠发育过程相关基因在结直肠癌变过程中的表达情况  45
    2、肠发育和结直肠癌变过程相关基因的生物学意义  45-46
    3、肠发育与结直肠癌变的关系  46
    4、肠道免疫系统的发育及其在癌变中的作用  46-49
  三、本章小结  49-50
第三章结直肠上皮内瘤变相关基因与结直肠癌患者预后的关系  50-72
  一、结果  50-68
    1、结直肠癌变相关mRNA表达谱分析  50-55
      1.1 结直肠癌变过程中差异表达的mRNA及其表达模式  50-51
      1.2 结直肠癌变过程中差异表达mRNA的功能富集  51
      1.3 结直肠癌发生发展过程的mRNA表达谱分布  51-55
    2、结直肠癌变相关miRNA表达谱分析  55
    3、miRNA-mRNA表达谱整合分析  55-63
    4、miRNA-mRNA调控网络中靶基因与结直肠癌患者预后的关系  63-67
    5、hsa-miR-135b靶基因的初步鉴定  67-68
  二、讨论  68-71
    1、结直肠癌变过程中mRNA表达谱变化特征  68
    2、结直肠癌相关miRNA-mRNA调控网络  68-70
    3、结直肠癌变早期相关分子事件与结直肠癌患者预后的关系  70-71
  三、本章小结  71-72
第四章结直肠正常黏膜和结直肠癌相关保守基因簇的初步研究  72-90
  一、结果  72-86
    1、结直肠癌变过程的时间序列  72-73
    2、结直肠癌变六个不同阶段的基因共表达相关性整体展示  73-74
    3、正常肠黏膜与结直肠腺癌保守基因簇的构建  74-75
    4、正常肠黏膜和结直肠癌特异保守基因簇的功能分析  75-76
    5、结直肠癌相关保守基因簇的调控基因预测  76-77
    6、初步验证保守基因簇中的基因及其调控基因  77-86
      6.1 挑选基因进行Real time PCR验证  77
      6.2 针对用于mRNA表达谱分析结直肠样本的Real time PCR验证  77
      6.3 针对结直肠正常黏膜和腺癌独立样本的Real time PCR验证  77-79
      6.4 保守基因簇基因及预测调控基因在起始样本和独立样本中表达的相关性分析  79-85
      6.5 MAFB对Cluster 16中基因调控的细胞水平验证  85-86
  二、讨论  86-89
    1、结直肠癌变的时间序列  86
    2、基因共表达网络在肿瘤研究中的价值  86-87
    3、结直肠正常黏膜和结直肠癌特异保守基因簇的构建与验证  87-89
  三、本章小结  89-90
第五章材料与方法  90-122
  一、实验材料  90-100
    1、结直肠腺瘤、腺癌组织标本  90
    2、结直肠正常黏膜组织标本  90
    3、人胚胎结肠组织标本  90-91
    4、实时定量PCR引物序列  91-93
    5、细胞系  93
    6、菌株及质粒载体  93
    7、克隆引物序列  93-94
    8、抗体  94
      8.1 第一抗体  94
      8.2 第二抗体  94
    9、主要试剂或试剂盒  94-98
      9.1 生物样品收集、制备和鉴定  94
      9.2 mRNA表达谱分析  94-95
      9.3 miRNA表达谱分析  95
      9.4 实时定量PCR分析  95
      9.5 其他主要试剂  95-98
    10、主要仪器  98-99
    11、RNA质量控制、生物信息学分析及绘图软件  99-100
  二、实验方法  100-122
    1、新鲜组织标本的收集  100
    2、总RNA样品的制备与鉴定  100-101
      2.1 提取新鲜冻存结直肠组织标本总RNA  100-101
      2.2 RNA样品的质量鉴定  101
      2.3 总RNA样品的纯化  101
    3、基因芯片检测mRNA表达谱  101-106
      3.1 配制单色Spike-in溶液  101-102
      3.2 荧光标记样品mRNA  102-103
      3.3 纯化标记后的产物cRNA  103-104
      3.4 纯化后cRNA的定量和质控  104
      3.5 mRNA表达谱芯片杂交  104-105
      3.6 清洗芯片  105
      3.7 芯片扫描和图像数据提取  105-106
    4、基因芯片检测microRNA表达谱  106-108
      4.1 荧光标记总RNA  106-107
      4.2 干燥标记后的样品  107
      4.3 miRNA表达谱芯片杂交  107
      4.4 杂交后的芯片清洗  107-108
      4.5 芯片扫描和图像数据提取  108
    5、芯片数据分析  108-110
      5.1 人肠发育与结直肠癌变基因表达谱分析  108
      5.2 结直肠样本mRNA表达谱数据和miRNA表达谱数据联合分析  108-110
      5.3 利用结直肠样本mRNA表达谱构建保守基因簇的数据分析  110
    6、实时荧光定量PCR分析  110-114
      6.1 RNA逆转录为cDNA  110-111
      6.2 实时荧光定量PCR的反应体系和反应条件  111-112
      6.3 绘制标准曲线  112
      6.4 样本检测  112
      6.5 统计学分析  112
      6.6 miRNA的实时定量PCR  112-114
    7、分子生物学实验方法  114-119
      7.1 构建MafB真核表达质粒  114-117
      7.2 提取细胞总RNA和总蛋白  117-118
      7.3 蛋白定量  118-119
      7.4 Western blot  119
    8、细胞生物学实验方法  119-122
      8.1 细胞复苏  119-120
      8.2 细胞冻存  120
      8.3 细胞传代  120
      8.4 脂质体介导的细胞转染  120-122
参考文献  122-129
课题基金资助  129-130
致谢  130-131

结直肠癌变相关基因表达谱的研究

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